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人PKM_2基因克隆、表达及蛋白纯化

作　者: 王秋香
导　师: 王海琳
学　校: 兰州大学
专　业: 妇产科学
关键词: PKM2 克隆表达纯化
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的构建人丙酮酸激酶基因PKM2(M2-type pyruvate kinse)的原核表达质粒pET30a(+)-PKM2,在大肠杆菌DH5α中进行基因扩增,导入大肠杆菌BL21中进行人丙酮酸激酶基因PKM2融合蛋白表达,镍离子柱亲和层析法纯化融合蛋白。方法用人HeIa细胞提取RNA,反转录获得人cDNA.以cDNA为模板,用PCR方法扩增出目的基因PKM2,用限制性内切酶(BarnH I.Sal I及Nde I.Sal I)对目的片段及质粒pET30a(+)进行双酶切,及T4DNA连接酶进行连接,并将它们依次插入到表达载体pET30a(+)的多克隆位点中构建重组质粒pET30a(+)-PKM2。经限制性内切酶(BamH I.Sal I及Nde I.Sal I)进行双酶切和DNA测序证实正确后,将此质粒转化入大肠杆菌BL-21(DE3)中表达融合蛋白PKM2,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),考马斯亮兰染色,在凝胶成像分析系统中分析纯化后蛋白情况。结果通过PCR方法,成功获得目的基因片段。经BamH I.Sal I及Nde I Sal I双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,北京六合华大基因科技服务有限公司测序结果和报道一致。经SDS-AGE分析,导入质粒载体pET30a(+)-PKM2后,大肠杆菌BL21成功大量表达PKM2融合蛋白；Ni-NTA亲和层析柱纯化后的蛋白约在58KDa位,条带单一,无杂带出现。结论成功构建了人PKM2基因的扩增质粒载体pET30a(+)-KM2；成功表达纯化了PKM2融合蛋白,为肿瘤疫苗研制和肿瘤标记物快速诊断的研究奠定基础。

全文目录

中文摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-7
第一章前言  7-11
第二章实验材料  11-14
  2.1 主要生化试剂  11
  2.2 主要仪器设备  11
  2.3 常用实验试剂和培养基  11-14
第三章实验方法  14-22
  3.1 全基因组RNA提取  14-15
  3.2 模板DNA制备(cDNA)  15-16
  3.3 融合蛋白pET30a(+)-PKM_2的构建  16-19
    3.3.1 引物设计  16
    3.3.2 PCR扩增PKM2基因  16-17
    3.3.3 构建表达质粒pET30a(+)-PKM_2  17-19
  3.4 目的蛋白的原核表达  19-20
    3.4.1 重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)  19
    3.4.2 重组融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)的诱导表达  19
    3.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  19-20
    3.4.4 重组融合蛋白表达形式的鉴定  20
    3.4.5 重组融合蛋白表达条件的优化  20
  3.5 重组融合蛋白的纯化  20-22
    3.5.1 细菌培养  20
    3.5.2 处理收集菌体  20-21
    3.5.3 层析纯化  21
    3.5.4 半透膜蛋白透析  21-22
第四章实验结果  22-28
  4.1 目的基因的克隆和序列分析  22-24
    4.1.1 Hela细胞全基因组RNA琼脂糖凝胶电泳结果  22-23
    4.1.2 目的基因PCR扩增结果  23-24
    4.1.3 重组质粒双酶切验证  24
    4.1.4 重组质粒的测序鉴定  24
  4.2 人PKM2重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达形式及表达条件的优化  24-26
    4.2.1 融合蛋白的表达形式  24-25
    4.2.2 目的蛋白表达条件的优化  25-26
  4.3. 含HIS标签的重组蛋白的纯化  26-28
    4.3.1 镍柱亲和层析纯化  26-27
    4.3.2 重组蛋白半透膜蛋白透析后结果  27-28
第五章讨论  28-31
  5.1 目的基因片段的克隆和序列分析  28-29
  5.2 目的基因片段的原核表达  29-30
  5.3 表达产物纯化  30-31
参考文献  31-34
附录  34-36
综述  36-43
  参考文献  41-43
在学期间的研究成果  43-44
致谢  44

人PKM_2基因克隆、表达及蛋白纯化

内容摘要

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