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铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统转录调控机制的研究

作　者: 孔伟娜
导　师: 段康民
学　校: 西北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 铜绿假单胞菌 Ⅲ型分泌系统 转座突变 ATP结合盒 双组分系统
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种人类机会致病菌,它可以引起严重感染并常常对人类生命造成威胁。Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system, T3SS)对于铜绿假单胞菌成功感染宿主细胞并逃离宿主免疫系统清除具有重要作用。研究铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统的表达调控机制可为开发治疗细菌感染的新方法提供理论基础。尽管过去十几年中有关Ⅲ型分泌系统的表达调控研究取得了一定的进展,但其关键调控途径的精确分子机制仍未完全研究清楚,在铜绿假单胞菌中仍有可能存在未知的Ⅲ型分泌系统关键调节因子。为了寻找未知的Ⅲ型分泌系统调节子,本文以Ⅲ型分泌系统中效应蛋白基因exoS的表达为线索,构建了含有约20000个单克隆的随机转座突变体库。获得的转座突变体染色体组上均整合有exoS-luxCDABE报道子,因此可通过发光强度的变化来筛选对exoS基因表达有影响的转座突变体。筛选得到目的突变菌株后,通过随机PCR、测序及序列比对最终确定了24个突变基因。在所鉴定的基因中,有4个基因突变后导致exoS基因的表达水平升高,20个基因突变后导致exoS表达水平降低,其中除了几个已知的与Ⅲ型分泌系统表达相关的基因外,如exsA与exsD基因,大部分筛选出来的基因在以前的研究中并没有被发现与Ⅲ分泌系统的表达相关。本研究针对其中的两个重要基因PA4595和PA1611进行了深入的研究,详细研究了这些基因的功能及其在调控Ⅲ型分泌系统基因表达中的分子机理。经本文研究发现,Ⅲ型分泌系统效应蛋白基因exoS的表达在PA4595基因的突变体中有明显升高,同时,其他几个Ⅲ型分泌系统相关基因exoY、exoT、exsCEBA以及exsD-pscB-L的表达在PA4595突变体中也都有明显增强,而且这一转录水平的提高可以反映在Ⅲ型分泌系统效应蛋白的分泌水平上。此外,该突变体的丛动能力及绿脓菌素产量较野生型均有明显的增加,同时生物被膜的产量较野生型有所减少。在该突变体染色体上互补单一拷贝的’PA4595完整基因可以将这些表型恢复至野生型水平。PA4595基因被预测编码ATP结合盒(ATP binding cassette, ABC)蛋白家族中的可溶性ATP酶,该基因与大肠杆菌(Escherichia coli)中的yjjK基因具有86%的序列相似性,在大肠杆菌中,yjjK基因编码的蛋白属于ABC蛋白家族中的REG亚家族蛋白。本研究表明,不同于大多数ABC家族蛋白,PA4595蛋白并不参与物质转运过程。通过定点突变实验我们发现,PA4595蛋白Walker B序列中保守的天冬氨酸残基对该蛋白发挥功能具有重要作用。同时,我们进行了PA4595蛋白的表达和纯化得到了重组的GST-PA4595蛋白,并证明该蛋白具有ATP酶活性。通过电泳迁移率变动分析实验我们发现,重组的GST-PA4595蛋白可通过序列非特异性的方式与DNA或RNA进行结合。这些结果为铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统基因的表达提供了一种新的调控因子,同时为进一步研究REG亚家族中的ATP酶蛋白提供了新的线索。铜绿假单胞菌可引起广泛的急性和慢性感染。双组分系统(two-component system, TCS)中的一些蛋白(RetS、LadS以及GacS/GacA)被发现是急慢性感染发展过程中的关键调节因子。本文研究发现,被预测属于双组分系统中感应激酶反应调节子杂合体的PA1611蛋白也参与急慢性感染转换过程中的基因表达调控。过表达PA1611蛋白可导致Ⅲ型分泌系统、细胞毒性以及细菌丛动能力的丧失,同时使生物被膜生成量明显增加。此外,PA1611可控制铜绿假单胞菌中两个小RNA (small RNA, sRNA)基因rsmY及rsmZ的表达。在PA1611过表达菌株中突变gacA基因可导致这些表型的丧失,而突变HptB信号途径中的PA3346基因对这些表型没有影响。这些现象与retS突变体的结果非常相似。通过定点突变实验我们发现,PA1611蛋白中保守的磷酸化残基对该蛋白的功能并不重要。同时,细菌双杂交实验显示PA1611蛋白与RetS蛋白之间存在直接的相互作用。此外,基因表达检测显示,正常条件下,PA1611基因在铜绿假单胞菌中的表达非常微弱。为了研究PA1611的表达环境及调控机制,我们通过第二轮转座突变发现了一个调控PA1611的新基因PA1775,该基因的突变可显著激活PA1611基因的表达。PA1775编码的细胞质膜蛋白被预测具有机械敏感性离子通道蛋白的结构域特征。由此我们推测,铜绿假单胞菌很可能通过细胞质膜蛋白PA1775来感应某些环境条件的变化,并将其转换为一定的信号来调控PA1611基因的表达水平。以上这些结果说明,当PA1611基因表达被激活时,过量的PA1611蛋白可通过与RetS之间的直接相互作用而不是磷酸化途径来调控细菌的急慢性感染过程。这一研究也为铜绿假单胞菌中其他的感应激酶反应调节子杂合体提供了一种新的作用机制。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-8
目录  8-15
第一章 绪论  15-35
  1.1 铜绿假单胞菌的致病机理  15-17
  1.2 Ⅲ型分泌系统  17-26
    1.2.1 铜绿假单胞菌中的Ⅲ型分泌系统组成  17-20
    1.2.2 铜绿假单胞菌中的Ⅲ型分泌系统调控网络  20-24
    1.2.3 Ⅲ型分泌系统在铜绿假单胞菌急性感染过程中的作用  24-26
    1.2.4 针对Ⅲ型分泌系统的治疗策略  26
  1.3 双组分系统  26-32
    1.3.1 双组分系统的组成和类型  27-28
    1.3.2 铜绿假单胞菌中的双组分系统  28-29
    1.3.3 Gac/Rsm系统与Ⅲ型分泌系统的关系  29-32
  1.4 ATP结合盒系统  32-34
  1.5 研究目的和意义  34-35
第二章 实验材料和方法  35-65
  2.1 实验材料  35-43
    2.1.1 菌株、质粒及引物  35-41
    2.1.2 培养基及培养条件  41-42
    2.1.3 实验试剂  42
    2.1.4 实验仪器  42-43
  2.2 实验方法  43-65
    2.2.1 碱裂解和SDS法制备质粒  43-44
    2.2.2 细菌基因组DNA提取  44
    2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  44-45
    2.2.4 铜绿假单胞菌感受态细胞的制备  45
    2.2.5 聚合酶链式反应(PCR)体系  45
    2.2.6 酶切和连接  45-46
    2.2.7 电转化  46
    2.2.8 基因表达载体构建  46-49
    2.2.9 基因表达水平的检测  49
    2.2.10 转座突变体库的构建和筛选  49-50
    2.2.11 转座子插入位点的确定  50-51
    2.2.12 基因敲除(Gene knockout)  51-52
    2.2.13 互补实验  52-53
    2.2.14 基因过表达实验  53
    2.2.15 定点突变(Site-directed mutagenesis)  53-56
    2.2.16 蛋白表达和纯化  56-57
    2.2.17 SDS-PAGE检测蛋白  57
    2.2.18 RNA体外转录实验  57-58
    2.2.19 核酸与蛋白结合实验  58
    2.2.20 Ⅲ型分泌系统效应蛋白检测  58-59
    2.2.21 细菌运动能力检测  59
    2.2.22 生物被膜检测  59-60
    2.2.23 刚果红实验  60
    2.2.24 绿脓菌素检测  60
    2.2.25 细胞毒性检测  60-61
    2.2.26 ATP酶活性检测  61-62
    2.2.27 细菌双杂交实验(Bacterial two-hybrid assay)  62-63
    2.2.28 胰蛋白酶限制性酶切蛋白实验  63-65
第三章 实验结果  65-98
  3.1 Ⅲ型分泌系统表达调控相关基因的筛选  65-69
    3.1.1 转座突变体库的构建  65
    3.1.2 转座突变体库的筛选  65-66
    3.1.3 突变体插入位点的确定  66-69
  3.2 PA4595基因功能的研究  69-83
    3.2.1 PA4595影响Ⅲ型分泌系统基因的转录  69-71
    3.2.2 PA4595影响Ⅲ型分泌系统效应蛋白的分泌  71-72
    3.2.3 PA4595影响生物被膜的形成、细菌的丛动能力以及绿脓菌素的产生  72-73
    3.2.4 PA4595与有机磷酸的转运无关  73-75
    3.2.5 PA4595定点突变分析  75-77
    3.2.6 PA4595蛋白的表达和纯化  77-78
    3.2.7 PA4595蛋白具有ATP酶活性  78-79
    3.2.8 ATP可诱导PA4595蛋白构象转变  79-80
    3.2.9 PA4595蛋白可与DNA或RNA直接结合  80-83
  3.3 PA1611基因功能的研究  83-98
    3.3.1 鉴定一株exoS表达降低的转座突变体  83-84
    3.3.2 过表达PA1611可抑制Ⅲ型分泌系统及细菌的运动能力并促进生物被膜的形成  84-88
    3.3.3 PA1611不通过HptB/PA3346/PA3347信号途径发挥作用  88-90
    3.3.4 PA1611通过Gac/Rsm调控途径发挥作用  90-92
    3.3.5 保守的磷酸化残基对PA1611的功能并不重要  92-93
    3.3.6 PA1611与RetS之间存在直接相互作用  93-95
    3.3.7 过表达PA1611可导致铜绿假单胞菌细胞毒性的丧失  95-96
    3.3.8 PA1775基因的突变可激活PA1611的表达  96-98
第四章 讨论  98-104
  4.1 铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统表达调控相关基因的筛选  98
  4.2 PA4595基因与Ⅲ型分泌系统及其他毒性因子表达的关系  98-100
  4.3 PA1611基因与Ⅲ型分泌系统及铜绿假单胞菌急慢性感染转换的关系  100-103
  4.4 小结  103-104
参考文献  104-117
攻读博士学位期间取得的科研成果  117-118
致谢  118-119
作者简介  119

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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