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副猪嗜血杆菌突变菌株的构建及生物学特性的研究

作　者: 吴娟
导　师: 何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌 转座 突变菌株
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起猪多发性浆膜炎与关节炎（也称Glasser’s病），是近年来新发现的猪的传染病。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄仔猪到4月龄的青年猪，给养猪业带来严重的经济损失。本病原菌共有15个血清型，不同血清型之间无交叉保护力，给目前具有交叉保护力的疫苗的研究带来困难。目前对该菌的分子生物学研究刚刚开始，许多基因的功能尚未了解。如能通过构建突变体库，获得不同表型特征的突变菌株，将有助于对不同基因进行功能性研究。 转座技术是近年来使用广泛的一种技术，利用转座子突变的特征有以下三点：（1）转座子因为具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变；（2）经转座子诱变的突变子含有已知的DNA片段，可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置；（3）经转座子诱变的突变体具有高度的极性，使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。转座技术已被用于基因功能的研究。 本实验运用Tn7转座子体外转座突变Hps血清5型的染色体DNA，再电转到亲本菌株内，与亲本菌的染色体DNA同源重组。从543个转化子中利用Kanr和PCR扩增插入片断的方法筛选得到20株的突变菌株，以小鼠为动物模型筛选到1株毒力减弱的突变菌株。其LD50为2.93×109CFU。与亲本菌株相比，毒力明显下降，用9.5×108CFU突变菌株免疫小鼠，2周后分别用5×LD50的野生菌（血清5型和血清4型）进行攻击，免疫小鼠对两种血清型的攻击获得一定程度的保护力。本试验为研发交叉保护力的弱毒疫苗奠定了初步的基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-7
第1章 文献综述  7-15
  1.1 副猪嗜血杆菌的研究进展  7-11
    1.1.1 病原特征  7-8
    1.1.2.致病性和毒力  8-9
    1.1.3.预防与免疫  9-11
  1.2.突变转座技术的研究进展  11-13
    1.2.1.转座子的结构和类型  11-12
    1.2.2.转座子在生物学研究中的应用  12-13
  1.3.构建细菌突变株的技术  13-15
第2章 研究的目的和意义  15-16
第3章 材料与方法  16-26
  3.1 材料  16-19
    3.1.1 菌株  16
    3.1.2 转座试剂盒  16-17
    3.1.3 酶及主要试剂  17
    3.1.4 主要培养基和抗生素  17-18
    3.1.5 缓冲液  18-19
    3.1.6 细菌基因组DNA提取试剂  19
    3.1.7 其它溶液  19
    3.1.8 实验动物  19
    3.1.9 本研究中所用的寡核苷酸引物  19
  3.2 实验方法  19-26
    3.2.1 细菌活化  19-20
    3.2.2 细菌(Hps)基因组DNA提取  20
    3.2.3 转座  20-22
    3.2.4 副猪嗜血杆菌电转化感受态细胞的制备  22
    3.2.5 副猪嗜血杆菌电转化  22-23
    3.2.6 突变菌株的快速鉴定  23-24
    3.2.8 SDS-PAGE电泳  24-25
    3.2.9 20个突变株对小白鼠致病力检测  25
    3.2.10 小鼠半数致死量(LD_(50))的测定(寇氏(Korbor)法)  25
    3.2.11 弱毒突变菌株对昆明鼠的免疫源性实验  25
    3.2.12 菌种的保存  25-26
第4章 结果与分析  26-31
  4.1 突变菌株的鉴定  26-27
    4.1.1 突变菌株的抗性(Kan~r)筛选  26
    4.1.2 PCR扩增转座插入序列  26-27
    4.1.3 PCR扩增16S rRNA  27
  4.2 毒力减弱突变菌株的初步筛选  27-29
  4.3 突变菌株(173#)的LD_(50)的测定  29
  4.4 突变菌株(173#)SDS-PAGE结果  29-30
  4.5 突变株对昆明小鼠的免疫原性试验  30-31
第5章 讨论  31-34
  5.1 关于突变株构建的目的  31
  5.2 构建突变株的策略  31-32
  5.3 影响转座突变的因素  32
  5.4 关于突变菌株的生物学特性  32-33
  5.5 SDS-PAGE的实验结果  33
  5.6下一步设想  33-34
第6章 小结  34-35
参考文献  35-41
略词表(Abbreviation)  41-43
致谢  43

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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