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Mariner转座子体内随机突变苏云金芽胞杆菌的研究

作　者: 李明磊
导　师: 喻子牛；李明顺
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: mariner 苏云金芽胞杆菌 转座 突变体
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 75次
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内容摘要


苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种在土壤中广泛分布的革兰氏阳性细菌,在芽胞形成期可以高效表达杀虫晶体蛋白并形成晶体。研究者通过各种分子手段探索杀虫晶体蛋白高效表达及其形成晶体的机制并取得了一定的成果,但对这种机制具体的作用方式,特别是晶体形成的分子机理,仍然不清楚。本文从mariner转座子在苏云金芽胞杆菌中的转座效率,插入位点偏爱性的有无以及是否存在插入热点等方面阐述了mariner转座子在苏云金芽胞杆菌中的转座特性,为苏云金芽胞杆菌突变体库的构建和晶体形成机制的研究提供了有力的工具。1.测定了mariner整合载体pMarA和pMarB在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和苏云金芽胞杆菌YBT2346中的转座特性。mariner转座子在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和野生菌株YBT2346中的转座效率均在10%左右。在BMB171中,插入位点的检测效率非常低,使得后续进行的插入位点分析难以进行。而在YBT2346中,插入位点的检测也非常低,而且检测到的都是同一位点。这可能是由于pMarA和pMarB的两个反向重复序列之间没有大肠杆菌的复制起点,而通过反向PCR或者总DNA酶切产物与线性pUC19连接的方法检测插入位点的效率同样非常低。这一缺陷使得插入位点的分析相当困难。2.重新构建了mariner整合载体pMarA333和pMarB333。与pMarA和pMarB相比,pMarA333和pMarB333在两个反向重复序列之间加入了大肠杆菌的复制起点,我们可以用合适的限制性内切酶处理总DNA、自连、转化E.coli DH5α便可以检测插入位点。3.测定了pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171和苏云金芽胞杆菌YBT881中的转座特性。pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中的转座效率分别为7.6%和11.6%。而在苏云金芽胞杆菌YBT881（CCAM 020673）中的转座效率分别为4.2%和15.7%。pMarA333和pMarB333显示出比另外一个mariner整合载体pAW068更高的转座效率,这可能是由于转座酶启动子的不同所导致的。限制性酶切分析发现,pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中没有明显的插入偏爱性。在苏云金芽胞杆菌YBT881的插入位点分析中,大部分插入位点的DNA序列都与两株已经完全测序的苏云金芽胞杆菌97-27（GI:49328240）和Al Hakarn（GI:118415003）进行BLAST分析。结果显示,mariner转座子的插入位点的分布比较分散,对非编码区没有偏爱性。此外,某些插入位点的序列和已经测定的苏云金芽胞杆菌质粒的序列有比较高的相似性,说明mariner转座子可以插入到质粒上。因此,mariner转座子是一个比较良好的转座诱变剂,没有偏爱性,可以随机地插入到染色体和质粒上,编码区和非编码区中。这对我们研究基因组不同位点的功能是非常有利的。pMarA333和pMarB333中所含有的温度敏感性复制起点pe194ts,壮观霉素抗性基因,红霉素抗性基因以及转座酶的启动子PA与ctc具有比较好的通用性。因此,pMarA333和pMarB333可在构建苏云金芽胞杆菌以及其他革兰氏阳性菌插入突变体库中具有比较高的潜在应用价值。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章 文献综述  10-27
  1.苏云金芽胞杆菌简介  10-11
  2.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白  11-13
    2.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的定位与分类  11-12
    2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构和功能  12-13
  3.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的表达与调控  13-20
    3.1 转录水平的调控  13-16
      3.1.1 依赖芽胞形成的cry基因的转录  13-14
      3.1.2 不依赖芽胞形成的cry基因的转录  14-15
      3.1.3 启动子及上游区和σ因子与转录调控  15-16
        3.1.3.1 启动子与转录调控  15
        3.1.3.2 启动子上游区和转录调控  15-16
        3.1.3.3 σ因子的竞争和转录调控  16
    3.2 转录后水平的调控  16-18
      3.2.1 mRNA3'末端的终止子结构  17
      3.2.2 mRNA5'末端的特殊结构  17-18
    3.3 翻译水平的调控  18
    3.4 影响cry基因表达的其他因素  18-20
      3.4.1 cry基因拷贝数对表达的影响  18-19
      3.4.2 宿主对cry基因表达的影响  19
      3.4.3 cry基因间的协同作用对表达的影晌  19-20
  4 杀虫晶体蛋白形成的机制及其影响因素  20-22
    4.1 P20蛋白  20-21
    4.2 P19蛋白  21
    4.3 ORF2和ORF1  21-22
  5 转座子  22-26
    5.1 转座子Tn916和Tn917  22-23
    5.2 转座子Tn10  23-24
    5.3 转座子mariner  24-26
  6 研究的立项依据和意义  26-27
第二章 材料与方法  27-36
  1 实验材料  27-30
    1.1 菌株与质粒  27
    1.2 培养基  27
    1.3 抗生素及其使用浓度  27
    1.4 试剂与器材  27-30
      1.4.1 试剂  27
      1.4.2 仪器  27-30
  2 实验方法  30-36
    2.1 DNA操作方法  30-32
      2.1.1 大肠杆菌质粒的提取  30-31
      2.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提  31
      2.1.3 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提  31-32
      2.1.4 DNA的体外重组操作  32
    2.2 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定  32-34
      2.2.1 大肠杆菌转化  32-33
      2.2.2 苏云金芽胞杆菌的转化  33
      2.2.3 大肠杆菌转化子的筛选  33-34
      2.2.4 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选  34
    2.3 mariner转座突变体的筛选和插入位点的检测  34-36
      2.3.1 mariner在苏云金芽胞杆菌内转座效率测定和转座突变体筛选  34
      2.3.2 mariner整合载体插入位点的检测  34-36
        2.3.2.1 采用反向PCR检测插入位点  34-35
        2.3.2.2 酶切产物连接检测插入位点  35
        2.3.2.3 酶切产物自连检测法插入位点  35-36
第三章 结果与讨论  36-56
  1 pMarA与pMarB在苏云金芽胞杆菌中的转座特性  36-44
    1.1 pMarA与pMarB在苏云金芽胞杆菌BMB171中的转座特性  36-40
      1.1.1 pMarA与pMarB在BMB171中的转座效率  36-37
      1.1.2 pMarA与pMarB在BMB171中的插入位点分析  37-40
    1.2 pMarA在苏云金芽胞杆菌YBT2346中的转座特性  40-42
      1.2.1 pMarA在YBT2346中的转座效率  40
      1.2.2 pMarA在YBT2346中的插入位点分析  40-42
    1.3 小结与讨论  42-44
  2 mariner转座子的整合载体pMarA333和pMarB333的构建  44-48
  3 pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌中的转座特性  48-56
    3.1 pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌BMB171中的转座特性  48-51
      3.1.1 pMarA333和pMarB333在BMB171中的转座效率  48-50
      3.1.2 pMarA333和pMarB333在BMB171的插入位点分析  50-51
    3.2 pMarA333和pMarB333在苏云金芽胞杆菌YBT881中的转座特性  51-53
      3.2.1 pMarA333和pMarB333在YBT881中的转座效率  51-53
      3.2.2 pMarA333和pMarB333在YBT881中插入位点分析  53
    3.3 小结与讨论  53-56
参考文献  56-64
致谢  64-65
附录  65

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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