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嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GSP基因簇的序列测定及分析

作　者: 罗玮
导　师: 闫志勇
学　校: 青岛大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 嗜麦芽寡养单胞菌 Ⅱ型分泌系统克隆测序
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的本实验室自沙蚕消化道分离得到的一株嗜麦芽寡养单胞菌D2可胞外大量分泌某蛋白(SMP)。根据已获知的部分基因组序列,发现该蛋白基因与Ⅱ型分泌系统蛋白基因成簇排列,故推测D2株SMP的大量分泌可能与Ⅱ型分泌系统有关。Ⅱ型分泌系统的研究为探索D2株蛋白高效分泌机制奠定基础。方法将已知的嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株SMP基因序列通过Blast软件进行对比,发现其与嗜麦芽寡养单胞菌K279a和R551-3的AKP基因序列有高度的同源性。采用基因移步法,根据菌株K279a和R551-3的基因组序列高保守区设计上游引物,根据已获知的D2株基因组序列设计下游引物进行聚合酶链反应,将PCR扩增获得的产物均连接至p MD18-T载体中并用TSS法转化大肠杆菌JM109。利用蓝白斑筛选阳性克隆,提取质粒后经双酶切鉴定确认为阳性的菌株菌液送测序。测序所得基因片段经DNASTAR软件拼接后通过Blast比对。利用ClustalX软件分析比对后得到的完整开放读码框与GenBank相关蛋白基因序列同源性,并用MEGA3.0软件进行系统发育分析;并对各蛋白的结构进行了分析和预测。结果以嗜麦芽寡养单胞菌D2株的基因组为模板进行PCR扩增、连接、转化、酶切鉴定、测序后,分别获得7个基因片段,经拼接分析后发现其中包含了11个完整开放读码框,分别对应于II型分泌系统GspF、GspE、GspD、 GspM、GspL、GspK、GspG、GspJ、Gspl、GspH、GspC蛋白(GenBank收录号依次为：GU377212、HM151387、JQ070336、JQ070343、1Q070342、JQ070341、JQ070337、JQ070340、JQ070339、JQ070338、JQ070335)。将该11个开放读码框翻译成蛋白质后与菌株R551-3的相应蛋白序列比对和系统发育分析后发现,测序获得的11种蛋白均与同种属细菌相应蛋白亲缘关系较近。结论成功获得了嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统gsp基因簇的完整基因序列,证明D2株gsp基因簇与smp紧密串联,且具有高度保守性,为进一步探索和开发利用D2株SMP蛋白高效胞外分泌表达机制奠定了基础。

嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GSP基因簇的序列测定及分析

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