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小鼠植入前胚胎DNA甲基化模式比较及Dnmts启动子功能分析

作　者: 杨旬旬
导　师: 李文雍
学　校: 安徽大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 昆明小白鼠 甲基化 启动子活性分析 基因克隆 重组质粒构建 共转染
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


为考查体外受精、操作及培养环境对体外受精的小鼠植入前胚胎全基因组DNA甲基化模式的影响,本研究以体内受精的植入前胚胎作为对照,采用间接免疫荧光法检测小鼠体内外受精植入前胚胎基因组DNA甲基化模式。实验结果表明：体外受精各期植入前胚胎呈现出与之相应时期的体内受精植入前胚胎不同的DNA甲基化模式和水平,原核期甲基化水平较高,2-、4-、8-细胞期明显降低,而桑葚胚和囊胚期又略有升高。各期体外受精植入前胚胎的基因组DNA甲基化水平都比同时期体内受精胚胎的甲基化水平低。本实验结果部分显示了体外受精、操作及培养环境可能对正常的DNA甲基化模式产生了影响,造成了体外受精植入前胚胎甲基化模式异常。作为基因表达开关的启动子是开启基因表达的重要顺式元件,可以受到反式因子的调控进而启动或关闭基因的表达。在本研究中,我们克隆小鼠Dnmtl、3a、3b基因启动子,构建了四段Dnmtl、3a、3b启动子5’缺失片段-pGL3分别称为Dnmtl-1、2、3、4、Dnmt3a-1、2、3、4，Dnmt3b-1、2、3、4以及Sox2、Oct4、Nanog、Klf4、c-Myc-pcDNA3.1,将转录因子和启动子重组质粒共转染HEK293细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统检测重组质粒荧光素酶报告基因的相对活性,考查转录因子对甲基化转移酶启动子活性的影响。研究结果表明：五种转录因子对Dnmtl-1活性的抑制作用较弱,而对Dnmtl-2、3、4(?)舌性的抑制作用较强。对Dnmt3a启动子各5’缺失片段的活性仍然是起到抑制作用,但不同的的转录因子对Dnmt3a启动子各5’缺失片段活性的抑制程度不同。Nanog对Dnmt3a-1活性的抑制作用较为明显,而对Dnmt3a-2、3、4的活性抑制作用差别不大；转录因子Oct4、c-Myc主要抑制区域出现在Dnmt3a-1启动子片段和Dnmt3a-2启动子片段之间；Sox2对Dnmt3a4个启动子片段的抑制作用区别不明显。5种转录因子对Dnmt3b-2、3启动子片段活性有较强的促进作用,其活性是对照组的7倍以上,但是转录因子对Dnmt3b-1、4启动子片段活性几乎没有任何作用,其荧光素酶活性与对照组相当。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
前言  8-14
  一、表观遗传概念及其在维持正常胚胎发育过程中的重要性  8-9
  二、iPS细胞的诞生为解决克隆胚发育率低以及胚胎治疗提供了新思路  9-12
  三、转录因子参真核生物基因表达调控简介  12-13
  四、启动子研究方法  13-14
    1、转染分析  13
    2、瞬时表达分析  13
    3、点突变分析  13-14
第一部分 小鼠体内外受精植入前胚胎全基因组甲基化模式比较  14-22
  引言  14-15
  1 实验材料与方法  15-19
    1.1 实验动物  15
    1.2 实验药品和耗材  15-16
    1.3 仪器设备  16
    1.4 实验试剂的配制  16-17
    1.5 实验方法  17-19
  2. 结果与分析  19-22
第二部分 Dnmts启动子克隆及功能分析  22-50
  引言  22
  1. 材料与方法  22-35
    1.1 实验材料  22
    1.2 实验试剂与耗材  22-23
    1.3 实验仪器  23
    1.4 实验方法  23-35
  2. 结果与分析  35-50
    2.1 小鼠全基因组DNA的提取  35-36
    2.2 小鼠Dnmt1、3a、3b基因启动子的克隆  36-40
    2.3 小鼠Dnmt1、3a、3b基因启动子5’缺失片段扩增  40-42
    2.4 启动子5’缺失片段-pGL3连接阳性克隆的鉴定及重组质粒的提取  42-44
    2.5 各转转录因子-pcDNA3.1重组质粒酶切鉴定  44-45
    2.6 各转录因子对Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b启动子5’缺失片段-活性的影响  45-50
讨论  50-54
  1. 小鼠体内外受精植入前胚胎全基因组甲基化模式比较  50-51
  2. 转录因子对DNMT启动子活性的影响  51-54
结论  54-55
参考文献  55-60
附录  60-63
硕士学习期间发表的主要论文  63-64
致谢  64

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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