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慢病毒介导的RNA干扰逆转单因素耐药细胞系K562/MDR1耐药性的研究
作 者: 叶雪石
导 师: 刘霆;龚玉萍
学 校: 四川大学
专 业: 内科学
关键词: 逆转录病毒 单因素耐药 MDR1基因 慢病毒 RNA干扰 shRNA
分类号: R733.7
类 型: 博士论文
年 份: 2007年
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内容摘要
研究背景耐药是化疗失败的一个主要原因。耐药产生的原因是多因素的,其中MDRl基因编码的P-gp蛋白最具代表性。在逆转MDR1基因的体外研究中通常采用的是药物诱导产生的耐药细胞系,其耐药为多种因素所致,且耐药性的维持不够稳定。逆转MDR1基因及其产物所致耐药的途径有多种,但从理论上讲,在基因水平逆转MDR1基因才是解决问题的关键。而近来发展起来的RNA干扰技术,为MDR1基因的逆转提供了一种新的高效特异的方法。慢病毒载体是一种很有前途的基因转移载体,可感染非分裂细胞,目的基因整合至靶细胞基因组而长期表达。通过慢病毒载体介导的RNA干扰,使长效抑制目的基因表达成为可能。研究目的1.构建MDR1基因单因素所致耐药细胞模型K562/MDR1。2.构建编码靶向MDR1基因shRNA的慢病毒载体。3.研究慢病毒介导的RNA干扰对MDR1基因所致耐药性的逆转情况。研究方法1.构建MDR1基因单因素耐药细胞系K562/MDR1:包装具MDR1基因全长cDNA的逆转录病毒,感染对化疗药物敏感的白血病细胞系K562,用秋水仙碱筛选耐药细胞,经无限稀释法克隆,得到单克隆的单因素耐药细胞系K562/MDR1。荧光定量PCR检测K562/MDR1的MDR1基因,流式细胞仪检测其P-gp蛋白表达,柔红霉素泵出实验检测P-gp蛋白功能,MTT试验检测其对化疗药物的敏感性。2.慢病毒介导的RNA干扰逆转MDR1基因所致耐药性:构建编码靶向MDR1基因shRNA的慢病毒载体并测序,包装慢病毒,感染耐药细胞系K562/MDR1和K562/A02,从以下四方面研究RNA干扰后其耐药性的变化:荧光定量PCR检测MDR1基因在mRNA水平的变化,流式细胞仪检测P-gp蛋白表达水平的变化,柔红霉素泵出实验检测细胞药物外排能力的变化,MTT试验检测细胞耐药性的变化。研究结果1.成功构建MDR1基因单因素耐药细胞系K562/MDR1:荧光定量PCR示MDR1基因相对定量值为2.79×10~3,远高于K562细胞;流式细胞仪检测细胞表面P-gp蛋白表达高达96.10%;柔红霉素泵出率为90.93%,显示了强大的药物外排能力;MTT结果示细胞明显对化疗药物耐药。2.成功构建编码靶向MDR1基因shRNA的慢病毒载体:合成编码shRNA的DNA序列亚克隆到慢病毒载体plentilox 3.7,测序结果示插入正确。3.慢病毒介导的RNA干扰能有效逆转MDR1基因所致耐药性:慢病毒显示出对耐药细胞高效、稳定的感染能力,有利于后续的RNA干扰实验。荧光定量PCR结果示RNA干扰后两种耐药细胞的MDR1基因水平均明显下调(K562/MDR1下调达100%,K562/A02下调达96.15%);流式细胞仪检测到细胞表面P-gp蛋白表达也明显下调(两种细胞均达100%);柔红霉素泵出试验证实干扰后耐药细胞药物外排能力的明显下降;MTT试验示RNA干扰后耐药细胞耐药性明显下降。各项指标均证实慢病毒介导的RNA干扰有效逆转了MDR1基因所致耐药性。结论1.采用逆转录病毒载体介导的转基因方法成功构建了MDR1基因单因素所致耐药细胞系K562/MDR1,为研究MDR1基因介导的耐药提供了更稳定,更特异的细胞模型。2.我们构建的编码靶向MDR1基因shRNA的慢病毒载体,可有效下调MDR1基因和P-gp蛋白表达,逆转MDR1基因介导的耐药,但基因下调与蛋白下调存在时间上的不同步。3.慢病毒介导RNA干扰,作用更为高效稳定,使长期的MDR1基因沉默成为可能。
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全文目录
中文摘要 5-8 英文摘要 8-12 前言 12-16 第一部分 利用逆转录病毒载体构建MDR1基因单因素耐药细胞系 16-40 材料和方法 16-28 结果 28-37 讨论 37-40 第二部分 MDR1小干扰RNA对转基因白血病耐药细胞株耐药性逆转的研究 40-63 材料和方法 40-47 结果 47-57 讨论 57-63 全文结论 63 本研究创新点 63-64 参考文献 64-68 文献综述 68-83 参考文献 78-83 致谢 83
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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