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核糖体失活蛋白（RIPs）基因的克隆及其对甜菜遗传转化的研究

作　者: 孙亚卿
导　师: 张少英；邵金旺
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 植物学
关键词: 抗病分子育种核糖体失活蛋白基因克隆甜菜遗传转化
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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引　用: 3次
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内容摘要

甜菜是世界上重要的糖料作物,但生产中甜菜病害较多,其产量和品质受到严重威胁。改变植物性状表现,转基因是最直接有效的手段。近年来,人们开始尝试通过遗传转化有目的地将抗病基因导入甜菜品种,从中选育抗病、丰产、优质的甜菜新品种。虽然国内外这方面的研究较多,但所取得的成效却甚微,其主要原因是甜菜再生较为困难,遗传转化体系基因依赖性强。植物遗传转化方法有很多,农杆菌介导法由于其可以转入的片段长,拷贝数少,遗传稳定性好等优点,一直是科学研究者重点研究的方法。前人的研究结果表明,核糖体失活蛋白(RIPs)具有抗病毒、真菌、细菌等多种抗性。本研究是通过PCR法,将玉米(Zea mays)RIPs基因克隆出来,构建重组质粒,利用农杆菌法将目的基因导入甜菜,并在已建立的甜菜再生体系基础上,对农杆菌介导的转化条件进行了优化,建立了稳定的甜菜子叶节遗传转化体系,获得转RIPs基因的甜菜植株,为甜菜抗病分子育种提供了基础材料和理论依据。目前取得的主要研究结果如下:1、利用PCR方法从玉米幼苗叶片总DNA中克隆到RIPs基因,并进行序列测定。该基因全长953bp,与文献报道的核苷酸序列具有99.90%的同源性,氨基酸同源性为100%;2、通过pMD18-T Vector这一克隆载体的介导,将RIPs基因与质粒pCAMBIA2301相连,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的植物双元表达载体,该载体含有npt II选择标记基因。3、优化了农杆菌介导的甜菜子叶节遗传转化体系,结果显示:将对数生长期的农杆菌重悬稀释后调浓度OD600值为0.4,子叶节外植体经过24h预培养,侵染时间8min,共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮,22℃～25℃共培养48～60h,经过Cb抑菌和125mg/L的Kan筛选,有利于甜菜子叶节的遗传转化。可得到最高的抗性芽率。4、用液氮冷冻法将重组质粒转入农杆菌LBA4404,实现了核糖体失活蛋白(RIPs)基因对甜菜的遗传转化,共获得抗性植株38株,PCR检测的阳性植株11株,阳性植株比率为28.9%。本研究进一步的相关工作正在进行中。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-13
1 引言  13-40
  1.1 植物抗病基因工程研究策略及进展  13-22
    1.1.1 植物抗病毒基因工程  13-19
    1.1.2 植物抗细菌病害基因工程  19-20
    1.1.3 植物抗真菌病害基因工程  20-22
    1.1.4 植物抗病基因工程的应用及存在的问题  22
  1.2 核糖体失活蛋白（RIPs）研究进展  22-30
    1.2.1 RIPs 在植物中的分布、分类及一般性质  23-24
    1.2.2 RIPs 的酶学活性  24-25
    1.2.3 RIPs 的作用机制及功能  25-28
    1.2.4 RIPs 在植物基因工程方面的应用  28-29
    1.2.5 RIPs 在医学方面的应用  29-30
    1.2.6 RIPs 研究展望  30
  1.3 甜菜基因工程研究进展  30-37
    1.3.1 植物基因工程在甜菜中的应用  30-33
    1.3.2 甜菜转基因方法  33-34
    1.3.3 甜菜基因工程的安全性评价  34-35
    1.3.4 存在的问题与研究展望  35-37
  1.4 本研究课题的目的意义及研究内容  37-40
    1.4.1 选题依据及意义  37-39
    1.4.2 主要研究内容  39-40
2 核糖体失活蛋白（RIPs）基因的克隆及序列分析  40-55
  2.1 材料与方法  40-48
    2.1.1 材料  40-41
    2.1.2 方法  41-48
  2.2 结果与分析  48-54
    2.2.1 玉米叶片总DNA 的提取  48
    2.2.2 PCR 扩增RIPs 基因  48-49
    2.2.3 重组质粒的鉴定  49-51
    2.2.4 基因序列的测定与分析  51-54
  2.3 讨论  54-55
3 农杆菌介导的甜菜遗传转化体系的优化  55-72
  3.1 材料与方法  55-58
    3.1.1 实验材料  55-57
    3.1.2 方法  57-58
  3.2 结果与分析  58-69
    3.2.1 甜菜种子表面灭菌方法的确定  58-59
    3.2.2 预培养时间对抗性芽获得的影响  59-60
    3.2.3 农杆菌的培养和侵染菌液的准备  60-61
    3.2.4 不同菌液浓度和侵染时间对抗性芽分化的影响  61-63
    3.2.5 共培养温度与时间对抗性芽分化的影响  63-64
    3.2.6 AS 对农杆菌转化效率的影响  64-65
    3.2.7 Kan 对子叶节转化筛选浓度的确定  65-67
    3.2.8 抗性苗的获得及抗性植株PCR 检测  67-69
  3.3 讨论  69-72
    3.3.1 受体材料、生长状况及基因型对甜菜遗传转化的影响  69
    3.3.2 农杆菌的生长状态对遗传转化的影响  69-70
    3.3.3 农杆菌侵染液浓度和侵染时间对甜菜转化的影响  70
    3.3.4 共培养环境对甜菜子叶节遗传转化的影响  70-72
4 RIPs 基因对甜菜的转化  72-89
  4.1 材料与方法  72-79
    4.1.1 试验材料  72
    4.1.2 试验方法  72-79
  4.2 结果与分析  79-83
    4.2.1 植物表达载体的构建  79
    4.2.2 转化农杆菌的鉴定  79-80
    4.2.3 抗性芽的获得  80-81
    4.2.4 生根及移栽  81-82
    4.2.5 转基因植株的PCR 检测  82-83
  4.3 讨论  83-89
    4.3.1 关于植物表达载体的构建  83-84
    4.3.2 高效再生体系的建立是甜菜遗传转化的关键  84-85
    4.3.3 农杆菌菌株类型对遗传转化的影响  85
    4.3.4 适宜转化方法的选择是转化成功的关键  85-86
    4.3.5 卡那霉素（Kan）筛选浓度对外植体存活率的影响  86-87
    4.3.6 甜菜遗传转化过程中阳性转化细胞和再生植株的一致性  87-89
5 结论  89-91
致谢  91-92
参考文献  92-105
作者简介  105

核糖体失活蛋白（RIPs）基因的克隆及其对甜菜遗传转化的研究

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