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西农萨能奶山羊泌乳初期和盛期乳腺差异表达基因的筛选、克隆鉴定及功能研究

作　者: 武会娟
导　师: 罗军
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 奶山羊 乳腺组织 泌乳期 差异表达基因 抑制性消减杂交
分类号: S827
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


乳腺是哺乳动物的泌乳器官,在奶山羊一个泌乳周期中乳腺经历与怀孕相关的增殖、分化和退化过程,与之相伴有分泌功能的乳腺上皮细胞也经历增殖、侵入、分化和调亡变化,这种正常的规律性生理变化直接影响或决定奶山羊泌乳期的长短、乳成分的变化和产奶量的高低,随着基因结构和功能研究的深入,人们逐渐认识到乳腺泌乳机能的规律性变化最终决定于其自身基因的差异表达。因此本试验以泌乳初期和泌乳盛期西农萨能奶山羊乳腺组织为试验材料,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建泌乳初期和泌乳盛期乳腺组织正反向消减cDNA文库、鉴定和克隆差异表达基因、实时定量PCR分析其表达模式、生物信息学预测其结构和功能,并对差异基因血清淀粉样蛋白A3(SAA3)进行初步的功能探讨,取得如下结果:1.利用SSH技术构建泌乳初期和泌乳盛期乳腺组织正反向消减cDNA文库:E-P(以泌乳初期为tester,以泌乳盛期为driver)和P-E(以泌乳盛期为tester,以泌乳初期为driver)消减cDNA文库,以看家基因甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)为指标检测两个文库的消减效率分别为210和25,表明差异表达于泌乳初期和盛期的基因在文库中的富集效率也达到210倍和25倍。2. E-P和P-E消减cDNA文库分别有56个和87个克隆,随机挑选有不同插入片断的30个克隆测序,分析结果得到E-P消减cDNA文库中的8个山羊EST序列,其中3个为山羊已知基因,5个为山羊未知基因,但与其它物种同名基因有95%以上的同源性,分别是免疫相关基因(CD36,黑素瘤相关抗原),骨形成相关基因(骨诱导因子),乳蛋白相关基因(α乳白蛋白,αS1酪蛋白,β酪蛋白,和γ酪蛋白);得到P-E消减cDNA文库中的18个山羊EST序列,其中1个为山羊已知基因,16个为山羊未知基因,但与牛对应基因有87%以上的同源性,1个为山羊线粒体序列,这些差异基因主要包括5类:细胞增殖分化相关基因:SAA3,ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2),H3组蛋白,前胸腺素α和层粘连蛋白受体1,脂肪代谢相关基因:心脏性脂肪酸结合蛋白(HFABP),黄嘌呤脱氢酶(XDH),转录复合体相关基因(核糖体蛋白S11、S12、S16、S19和R19),细胞能量供给相关基因(细胞色素氧化酶亚单位4和Vb)和4个未知基因。3.挑选P-E消减cDNA文库中的SAA3、ABCG2、HFABP和XDH基因片断进行实时定量分析,结果4个基因在泌乳盛期的表达丰度较泌乳初期分别提高17.0、7.6、16.0和5.02倍,均为阳性克隆。根据不同物种之间基因编码区的高度保守性和测序得到的山羊已知序列设计引物,首次克隆了山羊SAA3、ABCG2和XDH编码区并登陆GenBank: SAA3(ORF 396bp,GenBank No:DQ839400)、ABCG2(ORF 1977bp,GenBank No:DQ904356)、XDH(ORF 4002bp,GenBank No:EF151286),为有关基因的功能研究奠定基础。4.利用生物信息学对山羊、牛、人和鼠的SAA3、ABCG2、XDH和HFABP基因编码的蛋白进行结构和功能预测,结果发现山羊、牛、人和鼠这4个基因的ORF区和氨基酸序列高度同源,所编码蛋白的结构和潜在功能位点基本相同。SAA3为可分泌的两亲性蛋白,山羊SAA3较人和鼠SAA3多9个氨基酸,对应的多1个N糖基化位点和2个磷酸化位点;ABCG2是一个跨膜蛋白,有ATP结合盒、ABC转运子、ABCⅡ型转运子、P-loop核苷酸结合位点等功能域,能ATP依赖性的将多种脂类物质转运到胞外,山羊ABCG2跨膜区还有一个IMP脱氢酶/GMP还原酶功能域,推测它与山羊乳脂肪酸组成特点有密切关系;HFABP是一个网状‘开口’的亲脂蛋白,能结合和转运脂肪酸;XDH是有复杂空间结构的疏水蛋白,结构域中的1个钥(Mo)、1个黄素核苷酸辅基(FAD)和2个Fe/S丛组成其脱氢酶活性中心。5.以山羊GAPDH为内标,对SAA3、ABCG2、XDH和HFABP 4个基因在不同泌乳期(初期、盛期、中期、后期和末期)的mRNA表达模式进行实时定量分析。结果ABCG2、XDH和HFABP的mRNA变化趋势与泌乳曲线一致,从泌乳初期到盛期快速升高并达到最大值,之后缓慢下降,泌乳中期过后快速下降,在泌乳末期达最低值,推测它们是一个泌乳周期中乳腺泌乳机能变化的必要调节因子;SAA3的mRNA表达水平从泌乳初期到盛期逐渐升高,在泌乳中期相对稳定,泌乳中期过后快速升高,在泌乳后期达到最大值,之后快速下降,到泌乳末期表达丰度最低,推测SAA3在不同泌乳期参与脂类物质代谢、促进细胞增殖和保护乳腺等多种功能。6.将SAA3基因编码区构建到pET-32a(+)载体中进行原核表达,构建到绿色荧光表达载体pEGFP-C1和真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) A中转染人乳腺癌上皮细胞系MCF-7细胞进行细胞定位、MTT试验和对细胞脂肪酸代谢的影响,结果在大肠杆菌BL21中成功表达了带有组氨酸标签的35 kD的重组蛋白,优化后的表达条件为30℃,1mmol/L IPTG诱导3 h;SAA3定位于MCF-7细胞的细胞质和细胞膜;SAA3转染24 h后,正常培养条件的MCF-7细胞表现出促进生长趋势;细胞中C14:0含量比转染空质粒组提高3.63倍,其它脂肪酸(C16:0、C18:0、C18:1、C18:2)均低于对照组,说明SAA3调节乳腺上皮细胞增殖和脂肪酸代谢。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 文献综述  12-29
  1.1 乳腺功能调控研究进展  12-18
    1.1.1 乳腺上皮细胞与泌乳  12
    1.1.2 乳腺功能变化与激素调控  12-16
    1.1.3 乳腺功能变化与因子调控  16-18
  1.2 产奶量和乳成分研究进展  18-22
    1.2.1 产奶量和乳成分的变化规律  18
    1.2.2 乳腺上皮细胞的分泌途径  18
    1.2.3 乳脂  18-19
    1.2.4 酪蛋白  19-20
    1.2.5 乳铁蛋白  20-21
    1.2.6 乳白蛋白  21-22
    1.2.7 乳球蛋白  22
  1.3 基因差异表达研究方法  22-26
    1.3.1 mRNA 差异显示技术  22-23
    1.3.2 代表性差异分析  23-24
    1.3.3 抑制性消减杂交技术  24-25
    1.3.4 基因芯片技术  25
    1.3.5 基因表达的系统分析  25-26
  1.4 生物信息学分析进展  26-27
  1.5 研究的目的意义  27-29
第二章 西农萨能奶山羊泌乳初期和盛期乳腺组织差异基因的筛选和测序分析  29-48
  2.1 材料与方法  29-39
    2.1.1 材料  29-30
    2.1.2 方法  30-39
  2.2 结果与分析  39-43
    2.2.1 泌乳初期和盛期乳腺组织中总RNA 的提取  39
    2.2.2 泌乳初期和盛期乳腺组织中mRNA 的纯化和浓缩  39-40
    2.2.3 消减效率检测  40-43
    2.2.4 文库质量鉴定  43
    2.2.5 消减文库的测序和分析  43
  2.3 讨论  43-47
    2.3.1 泌乳初期差异基因  43-44
    2.3.2 泌乳盛期差异基因  44-45
    2.3.3 抑制性消减杂交技术  45-47
  2.4 小结  47-48
第三章 SAA3、ABCG2、HFABP 和XDH 基因的鉴定与克隆  48-57
  3.1 材料与方法  48-52
    3.1.1 材料  48
    3.1.2 方法  48-52
  3.2 结果与分析  52-53
    3.2.1 实时定量PCR 检测差异表达基因  52-53
    3.2.2 RT-PCR 扩增山羊SAA3、ABCG2 和XDH 基因编码区序列  53
  3.3 讨论  53-56
    3.3.1 实时定量PCR  53-54
    3.3.2 基因克隆方法  54-55
    3.3.3 PCR 引物设计体会  55
    3.3.4 PCR 条件优化  55-56
  3.4 小结  56-57
第四章 SAA3、ABCG2、HFABP 和XDH 的生物信息学分析  57-74
  4.1 方法  57
  4.2 结果与分析  57-70
    4.2.1 SAA3 的生物信息学分析  57-60
    4.2.2 ABCG2 的生物信息学分析  60-64
    4.2.3 HFABP 的生物信息学分析  64-66
    4.2.4 XDH 的生物信息学分析  66-70
  4.3 讨论  70-72
    4.3.1 SAA3  70-71
    4.3.2 ABCG2  71-72
    4.3.3 HFABP  72
    4.3.4 XDH  72
  4.4 小结  72-74
第五章 SAA3、ABCG2、HFABP 和XDH 基因的表达分析  74-78
  5.1 材料与方法  74
    5.1.1 材料  74
    5.1.2 方法  74
  5.2 结果与分析  74-75
    5.2.1 4 个基因的实时定量结果  74-75
  5.3 讨论  75-77
    5.3.1 SAA3  75-76
    5.3.2 ABCG2  76
    5.3.3 HFABP  76-77
    5.3.4 XDH  77
  5.4 小结  77-78
第六章 SAA3 基因的原核表达及功能初探  78-99
  6.1 SAA3 基因的原核表达  78-86
    6.1.1 材料与方法  78-82
    6.1.2 结果与分析  82-85
    6.1.3 讨论  85-86
  6.2 SAA3 蛋白细胞内定位及其对MCF-7 细胞生长和脂肪酸代谢的影响  86-98
    6.2.1 材料和方法  86-90
    6.2.2 结果与分析  90-98
  6.3 小结  98-99
主要结论  99-100
本研究的创新点  100
进一步研究的问题  100-101
参考文献  101-114
附录  114-116
致谢  116-117
作者简介  117

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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