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利用cDNA-AFLP技术分析棉花耐旱相关基因的表达

作　者: 邓晓艳
导　师: 魏亦农
学　校: 石河子大学
专　业: 遗传学
关键词: 棉花干旱胁迫 cDNA-AFLP 差异表达基因半定量RT-PCR
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

干旱是全世界面临的严重问题之一,同时也是制约我国农业生产的主要因素,因此,提高作物的抗旱能力是现代农业研究工作中的重点和热点问题之一。棉花是我国乃至全球重要的经济作物,新疆隶属于干旱荒漠地带,气候比较干燥,同时也是我国最大的棉花生产基地之一,棉花属耗水作物,农业方面用水危机越来越突出,干旱严重制约着新疆棉花的进一步发展。由于缺乏有效的选择手段及棉花本身耐旱性状的复杂性,一直以来,人们采用传统的常规选育等方法解决棉花品种的干旱问题往往工作量大、耗资大而且选择效率不高。随着分子生物学术的不断发展,运用分子遗传学、分子生物学等方法通过基因工程的手段培育抗逆品种已经成为现代农业研究的重要内容。本研究以棉花耐旱品种晋棉13号为研究材料,利用cDNA-AFLP技术筛选并克隆与干旱胁迫相关的基因,通过对目的基因片段在植物不同胁迫时间点及不同组织中的表达量进行分析,进一步解析植物的耐旱机制,为棉花抗逆育种提供候选基因及理论依据。主要研究结果如下：1、采用水培法培养了晋棉13号正常生长和PEG6000(20%和30%)处理1h、2h、4h、6 h、8 h、10 h、12 h和24 h的幼苗,提取了高质量的叶片总RNA。2、选用64对引物组合,对正常生长和干旱处理不同时间点叶片转录产物进行cDNA-AFLP分析。共分离得到232个差异表达的转录衍生片段(TDFs),对其中102个TDFs进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：57个TDFs与NCBI中已有序列同源,8条为重复序列,比对出同源序列但缺少生物学功能的TDFs 19个,已知可能生物学功能的TDFs30个。另有45个TDFs无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。3、比对结果显示,已知可能生物学功能的30个TDFs分别归属于信号转导、代谢、光合作用调节、逆境响应等。光合作用调节蛋白基因包括光调节蛋白基因(TDF89)；信号转导相关基因包括ATP结合蛋白基因(TDF3)、磷脂酰甘油磷脂酶C基因(TDF45和TDF62)、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(TDF64)、F-box结构域蛋白(TDF75)、受体蛋白激酶(TDF93)；核酸代谢相关基因为推测的反转录酶(TDF34)和反转录转座子蛋白(TDF7)；生物合成关键酶基因为淀粉分支酶基因(TDF1和TDF2)；蛋白质合成与修饰相关基因包括RNA解螺旋酶蛋白(TDF80)、真核翻译起始因子EIF4A(TDF87)；逆境响应相关基因包括水稻渗透响应蛋白(TDF12)、抗锈病蛋白(TDF29)、冷胁迫相关蛋白(TDF31)、干旱诱导相关蛋白(TDF42和TDF81)、拟响应调控基因(PRR)(TDF52)、耐药分泌蛋白(TDF101)；代谢途径相关酶类基因包括乙酰辅酶A羧化酶(TDF43)、细胞色素P450基因(TDF5和TDF44)、氨基甲酰磷酸合成酶(TDF60)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(TDF61)、磷酸转移酶(TDF70)、NADH脱氢酶(TDF78)、乙醇脱氢酶基因(TDF97)；离子转运相关蛋白为液泡膜H+-ATPase(TDF33);转录因子为EREBP转录因子(TDF76)。4、选取三个与棉花耐旱密切相关的cDNA片段(TDF42、TDF61、TDF62),利用半定量RT-PCR法分析其在棉花叶片不同胁迫时间点以及在不同组织中的表达量,结果表明磷酸烯醇丙酮酸激酶(TDF61)在正常水分供应下表达水平很低,在干旱胁迫条件下先增强后减弱,在8小时达到最高值。8小时根、茎、叶中的表达量为叶中最高,茎中次之,根中最低；水分胁迫条件下得到的cDNA片段(TDF42)的表达情况为在正常水分供应下基本上无表达,随着时间的延长逐渐增强,在10小时达到最高值,后逐渐减弱。10小时时根的表达量最高,茎中次之,叶中最低；磷脂酶C(TDF62)在正常供水情况下表达量也低,随着胁迫时间的延长表达量逐渐增强,在12小时达到最高,此后表达量基本处于稳定,12小时时根茎叶中该基因的表达量差别不大。因此,初步推测这三个TDFs与棉花耐旱相关。5、以上结果表明利用cDNA-AFLP技术分离差异表达片段进行相关基因的研究是可行的。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-11
缩略词表  11-12
引言  12-13
第一章文献综述  13-25
  1.1 棉花耐旱的研究进展  13-20
    1.1.1 干旱胁迫对作物的危害  13
    1.1.2 旱害的机理  13-14
    1.1.3 植物耐旱的机理  14-17
    1.1.4 棉花耐旱相关基因的研究进展  17-20
  1.2 棉花耐旱相关基因的研究方法  20-24
    1.2.1 cDNA扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)技术  20-21
    1.2.2 cDNA-AFLP技术的原理和方法  21
    1.2.3 cDNA-AFLP技术的优缺点  21-22
    1.2.4 cDNA-AFLP技术的操作要点  22-23
    1.2.5 cDNA-AFLP技术在基因差异表达研究上的应用  23-24
  1.3 本研究的目的和意义  24-25
第二章试验材料和方法  25-36
  2.1 材料  25
    2.1.1 植物材料  25
    2.1.2 主要试剂  25
    2.1.3 菌株和载体  25
    2.1.4 主要仪器  25
  2.2 方法  25-36
    2.2.1 材料培养及处理  25-26
    2.2.2 cDNA-AFLP操作过程  26-32
    2.2.3 差异条带DNA的回收和克隆  32-34
    2.2.4 半定量RT-PCR法分析棉花耐旱相关基因的表达  34-36
第三章结果与分析  36-45
  3.1 RNA的提取结果及cDNA的质量  36
  3.2 预扩增结果检测  36
  3.3 选择性扩增结果检测  36-38
  3.4 回收片段的二次扩增  38
  3.5 差异片段的克隆  38-39
  3.6 差异表达基因的同源性分析  39-42
  3.7 差异表达基因的功能分析  42-43
  3.8 差异表达基因的半定量RT-PCR分析  43-45
第四章讨论  45-50
  4.1 总RNA的提取  45
  4.2 关于棉花耐旱相关基因研究中cDNA-AFLP的应用  45-46
  4.3 干旱胁迫条件下差异表达基因的功能及其模式  46-48
  4.4 干旱胁迫条件下差异基因的表达  48-50
第五章结论与展望  50-52
  5.1 结论  50-51
  5.2 展望  51-52
参考文献  52-57
附录1 主要溶液的配制  57-60
附录2 差异片段序列  60-66
作者简介  66-67
致谢  67-68
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表  68

利用cDNA-AFLP技术分析棉花耐旱相关基因的表达

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