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鲨鱼软骨抗血管生成多肽的分离纯化及其生物活性

作　者: 郑兰红
导　师: 林秀坤
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 鲨鱼软骨 多肽 新生血管生成 分离纯化 N-末端序列
分类号: R914
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 445次
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内容摘要


以血管生成为靶点的抗肿瘤策略是抗肿瘤领域的研究热点,目前已经发现许多天然和化学合成的抗血管生成药物。鲨鱼软骨作为抗新生血管生成因子的重要来源的研究已有20多年的历史,很多研究显示鲨鱼软骨提取物有抗血管生成活性。但鲨鱼软骨活性多肽的完整分子结构一直未见报道;鲨鱼软骨活性多肽干扰血管生成通路的信号途径尚不明确。本文应用盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀、超滤、凝胶层析等分离技术,从青鲨(Prionace glauca)软骨中分离纯化并鉴定了一种新的具有抗新生血管生成活性的多肽。经SDS-PAGE和N-末端氨基酸序列分析显示,该多肽分子量为15500 Da,采用蛋白数据库分析表明该多肽是一种新发现的鲨鱼软骨多肽(Polypeptide from Prionace glauca,PG155)。体外实验显示,PG155抑制内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell ,HUVEC)迁移和管腔形成,并呈剂量依赖关系。200μg/ml PG155对牛主动脉内皮细胞(Bovine Aortic Endothelial Cells,BAECs)和HUVECs及以下癌细胞,包括人肝癌细胞(human hepatoma Bel-7402 cells,Bel-7402)、口腔上皮癌细胞(human oral epidermoid carcinoma KB cells ,KB)、人结肠癌细胞(human colon cancer HCT-18 cells,HCT-18)和人乳腺癌细胞(human breast MCF7 cancer cells ,MCF7)的增殖均无抑制作用,说明PG155无细胞毒作用。20μg/ml PG155显著抑制HUVEC的迁移和管腔形成;40-80μg/ml PG155对VEGF介导的HUVEC的迁移和管腔形成几乎完全抑制。体内实验显示,PG155显著抑制斑马鱼胚胎模型新生血管生成,并呈剂量依赖关系。形态学观察表明PG155显著抑制斑马鱼胚胎肠下静脉(subintestinal vessels, SIVs)的生长,随着浓度的升高SIVs的生长可受到完全抑制。碱性磷酸酶染色分析显示,在一定浓度范围内,PG155随着浓度的升高对斑马鱼胚胎整体血管生成抑制作用依次增强。160μg/ml PG155会引起斑马鱼胚胎心脏功能障碍。由海洋生物中发现新的肿瘤新生血管生成抑制剂国内外的报道较少,我们的工作表明鲨鱼软骨可作为血管生成抑制剂的重要来源,鲨鱼软骨活性多肽PG155由于具有极低的细胞毒作用,并能抑制VEGF介导的血管生成过程,有希望成为一类新型抗肿瘤药物。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
第一章 文献综述  9-44
  第一节 血管生成与肿瘤治疗  10-19
    1. 肿瘤生成研究  10-11
    2. 血管生成研究  11-16
    3. 血管生成与肿瘤治疗的关系  16-19
  第二节 肿瘤新生血管生成抑制作为一种抗肿瘤策略  19-42
    1. 抗血管生成的主要治疗靶点  19-22
    2. 抗血管生成抑制剂的临床研究  22-30
    3. 鲨鱼软骨血管生成抑制因子国内外研究现状  30-37
    4. 斑马鱼作为一种新型的肿瘤新生血管生成检测模型  37-40
    5. 肿瘤新生血管生成抑制研究展望  40-42
  第三节 研究目的和意义  42-44
第二章 鲨鱼软骨抗新生血管生成多肽PG155 的分离纯化  44-68
  第一节 材料和方法  45-54
    1. 材料  45-46
    2. 鲨鱼软骨多肽的分离纯化  46-48
    3. SDS-PAGE检测  48-51
    4. 质谱分析  51-52
    5. N -末端氨基酸序列分析  52-54
  第二节 结果  54-67
    1. 鲨鱼软骨粗提物的制备  54
    2. 鲨鱼软骨抗新生血管生成活性多肽的制备  54-55
    3. 鲨鱼软骨多肽SDS-PAGE分析结果  55-56
    4. 质谱分析结果  56-63
    5. N-末端分析结果  63-67
  第三节 讨论  67-68
第三章 PG155 在体外对内皮细胞迁移和管腔形成的影响  68-84
  第一节 材料和方法  69-76
    1. 材料  69-71
    2. MTT法检测PG155 对内皮细胞和肿瘤细胞增殖的影响  71-72
    3. BrdU检测PG155 对内皮细胞增殖的影响  72-73
    4. PG155 对VEGF介导的内皮细胞的迁移实验  73-74
    5. PG155 对VEGF介导的内皮细胞的管腔形成实验  74-76
  第二节 结果  76-82
    1. PG155 对内皮细胞和肿瘤细胞的细胞毒作用  76
    2. PG155 对内皮细胞增殖的抑制作用  76-77
    3. PG155 对VEGF介导的内皮细胞的迁移的抑制作用  77-79
    4. PG155 对VEGF介导的内皮细胞的管腔形成的抑制作用  79-82
  第三节 讨论  82-84
第四章 PG155 对斑马鱼胚胎新生血管生成的影响  84-96
  第一节 材料和方法  84-89
    1. 材料  84-85
    2. 形态观察法检测PG155 在斑马鱼胚胎体内的抗血管生成活性  85-87
    3. 定量EAP染色法检测PG155 对斑马鱼胚胎整体的抗血管生成活性  87-89
  第二节 结果  89-94
    1. PG155 对斑马鱼胚胎新生血管生成的抑制作用  89-92
    2. PG155 对斑马鱼胚胎整体血管生成的抑制作用  92-94
  第三节 讨论  94-96
结论  96-98
参考文献  98-111
缩略语  111-113
发表文章目录  113
专利情况  113-114
致谢  114

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物化学
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