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D-氨甲酰水解酶可溶性表达的遗传改造和结构与功能研究

作　者: 姜世民
导　师: 姜卫红
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 微生物学
关键词: 皮氏伯克霍尔德氏菌 D-氨甲酰水解酶分子伴侣定向进化可溶性表达结构模建发酵
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

大肠杆菌重组表达系统的主要问题之一,是过量表达的目的蛋白常常以不可溶的形式存在,因而不具有生物学活性。这影响了许多蛋白的性质研究和工业应用,因此需要建立新型有效的改造方法。本论文以重要工业用酶D-氨甲酰水解酶（D-carbamoylase, DCase）为研究对象,通过共表达和基因改造技术提高其在大肠杆菌中的可溶性表达,并对突变体进行结构与功能研究。D-氨甲酰水解酶是β-内酰胺类抗生素中间体D-对羟基苯甘氨酸制备的关键酶。我们克隆了一个来源于皮氏伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pickettii）的D-氨甲酰水解酶,但在大肠杆菌过量表达后,80%左右目的蛋白以包涵体的形式存在,所以基因工程菌的酶活力比较低,成为工业应用瓶颈。为提高D-氨甲酰水解酶在大肠杆菌中的可溶性表达,首先采用了分子伴侣共表达技术。将三种分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE（DnaKJE）、GroEL-GroES（GroELS）和trigger factor（TF）分别与D-氨甲酰水解酶共表达。结果显示,在分子伴侣GroESL的辅助下,D-氨甲酰水解酶在大肠杆菌表达系统中的可溶性明显增加,相比于野生型,酶活提高了3倍。然而在实际应用中会涉及分子伴侣诱导物可使用性问题,因此我们又尝试了基因定向进化的方法。定向进化技术是在实验室里模拟自然进化的过程,通过对编码蛋白质的基因进行随机突变,从而定向筛选出特定突变体的有效方法。我们首先使用易错PCR和DNA Shuffling操作,对DCase基因进行随机突变,再通过一种蛋白质可溶性结构互补监测系统将正突变检出,筛选获得了一系列可溶性表达增加的突变体。通过详细分析这些突变体的氨基酸序列,并结合定点突变鉴定这些突变位点,揭示了与DCase的可溶性表达密切相关的三个重要氨基酸残基A¹⁸、Y³⁰和K³⁴。同源四聚体和单体的结构模建结果显示,A¹⁸位于β-折叠片和α-螺旋之间的一个转角上,而Y³⁰和K³⁴位于同一个α-螺旋,且三个突变点都位于蛋白分子的表面,远离蛋白的催化和活性中心。进一步的定点替换突变分析表明,这三个氨基酸残基的电荷改变和（或）亲水性的变化是D-氨甲酰水解酶突变体在E. coli中可溶性表达增加的两个关键因素。突变酶A18T和Y30N可溶性的增加主要由于突变位点氨基酸残基亲水性的提高;而K34E突变酶可溶性的提高可能主要归功于蛋白负电荷的增加。在此基础上,又对这三个位点进行了组合突变。SDS-PAGE结果表明,其中一个命名为DCase-M3的三联突变体（A18T/Y30N/K34E）在E. coli过量表达时,80%以上的目的蛋白成为可溶状态,很好地体现了有效突变的叠加作用。此外,对纯化的野生型DCase和突变型DCase-M3进行了酶学性质测定和对比,二者在动力学常数、热力学稳定性、最适温度、最适pH以及热稳定性等方面相似,可见在突变提高可溶性表达的同时并没有改变D-氨甲酰水解酶原有的特性。在上述研究的基础上,为了进一步弄清所获得的可溶性显著提高的D-氨甲酰水解酶突变体在工业发酵中应用的可行性,我们进行了D-氨甲酰水解酶改造前后发酵活力的比较实验。首先对野生型D-氨甲酰水解酶和单点突变D-氨甲酰水解酶K34E进行多种组合的摇瓶发酵实验,包括使用三种不同的培养基（LB、TB和改良的工业培养基）和三种不同的诱导温度（22℃、30℃和37℃）。结果显示,在所使用的培养条件下,单点突变D-氨甲酰水解酶K34E的酶活都不同程度地优于野生型。同时我们综合考虑D-对羟基苯甘氨酸制备的两个关键酶:D-乙内酰脲酶（DHase）和D-氨甲酰水解酶（DCase）,通过引入突变DCas（eK34E）,串联构建了一菌两酶的大肠杆菌基因工程菌株E.coli BL21（DE3）/pCHWT（DHase/ DCase）和E.coli BL21（DE3）/pCHMU（DHase/ K34E）。发酵结果显示,突变工程菌E. coli BL21（DE3）/pCHMU表现出的DHase/DCase的综合催化效率明显高于E. coli BL21（DE3）/pCHWT,提高近一倍。此外,我们还对高可溶性表达的三突变酶DCase-M3进行了5升发酵罐发酵研究,结果说明,在放大发酵培养的条件下,突变酶DCase-M3与野生型DCase相比活力提高了近7倍,表现出很大的工业应用潜力。

全文目录

目录  2-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
综述部分  10-45
  第一章酶体外定向进化的研究进展  11-25
  第二章 D-氨甲酰水解酶的研究进展  25-45
论文部分  45-114
  前言  45-46
  第一章利用分子伴侣提高D-氨甲酰水解酶的可溶性表达  46-64
    摘要  46
    关键词  46-47
    1. 引言  47-48
    2. 材料与方法  48-52
    3. 结果  52-59
      3.1 来源于Burkholderia pickettii D-氨甲酰水解酶基因在大肠杆菌中的表达  52-55
      3.2 分子伴侣在大肠杆菌中的表达  55-57
      3.3 分子伴侣与D-氨甲酰水解酶的共表达  57-59
    4. 讨论  59-60
    5. 小结  60-61
    参考文献  61-64
  第二章 D-氨甲酰水解酶可溶性表达的定向进化和结构与功能研究  64-97
    摘要  64
    关键词  64-65
    1. 引言  65-67
    2. 材料与方法  67-72
    3. 结果  72-89
      3.1 通过定向进化获得可溶性表达提高的DCase 突变体  72-76
      3.2 识别与DCase 可溶性有关的功能位点  76-79
      3.3 有效突变位点的叠加构建及可溶性表达分析  79-81
      3.4 野生型DCase 和突变体DCase-M3 的酶学性质比较  81-85
      3.5 三个有效位点的变换突变及分析  85-87
      3.6 DCase-M3 三维模建结构的分析  87-89
    4. 讨论  89-92
    5. 小结  92-93
    参考文献  93-97
  第三章 D-氨甲酰水解酶的发酵条件及改造前后的发酵活力分析  97-112
    摘要  97
    关键词  97-98
    1. 引言  98-99
    2. 材料与方法  99-103
    3. 结果与讨论  103-110
      3.1 诱导温度对酶发酵单位的影响  103-104
      3.2 不同培养基对酶表达的影响  104-106
      3.3 一菌两酶（DHase/DCase）的构建和表达  106-108
      3.4 野生型 DCase 和突变酶DCase-M3 的放大发酵试验  108-110
    4. 小结  110-111
    参考文献  111-112
  结论  112-114
附录:本文缩写汇编  114-116
在学期间发表文章、会议报告及专利  116-117
致谢  117

D-氨甲酰水解酶可溶性表达的遗传改造和结构与功能研究

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