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鱼皮胶原蛋白的制备及胶原蛋白多肽活性的研究

作　者: 林琳
导　师: 李八方
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工与贮藏工程
关键词: 水产加工废弃物胶原蛋白活性多肽抗氧化 ACE抑制
分类号: TS201.21
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本文主要是利用酶工程技术，以资源较多并且集中的鱿鱼、鳕鱼和鲤鱼为主要的利用对象，通过选择适宜的蛋白酶和控制酶解过程，研究开发水产胶原蛋白及其寡聚肽制品。首先，分别以鱿鱼皮、鳕鱼皮和鲤鱼皮为原料，通过采用不同提取方法提取胶原蛋白，并对所提取的鳕鱼皮、鱿鱼皮和鲤鱼皮的胶原蛋白的理化性质进行测定，电泳测定鳕鱼皮、鱿鱼皮和鲤鱼皮胶原蛋白的分子量分别为220 kDa、220 kDa和260 kDa，测定了鲤鱼皮、鱿鱼皮和鳕鱼皮胶原蛋白的热变性温度（T_d）分别为31.9℃、26.8℃和24.2℃。其次，采用不同的酶解工艺条件，制备生理活性不同的胶原蛋白多肽产物。确定了制备具有清除自由基活性的鱼皮胶原蛋白多肽的最佳酶解工艺条件：采用碱性蛋白酶properase E作为水解用酶，水解pH9.0，水解温度为45℃、酶与底物比为1：50，水解时间为3 h。选用双酶A（properase E）和B（胃蛋白酶），进行复合酶解试验，得到的水解产物无论是对羟自由基还是超氧阴离子自由基都有最高的清除活性。选用截留分子量分别为10k、6k和2kDa的超滤膜，对鱼皮胶原蛋白水解产物进行超滤粗分离，实验结果表明，不同分子量范围的多肽组分对O₂^·-和·OH清除活性不同，清除活性随分子量的减小而增大。测定了不同水解条件对于胶原蛋白多肽产率的影响，在温度55℃，pH值为8.0，酶与底物浓度比为4％的条件下，用碱性蛋白酶properase E水解鱼皮胶原蛋白多肽产率最高。以ACE抑制活性为指标，确定酶解制备胶原蛋白ACE抑制肽的最佳反应条件为：酶与底物比为2％、pH为2.0、水解温度为45℃、水解时间5 h。采用两种酶，胃蛋白酶和碱性蛋白酶进行复合水解得到的多肽的ACE抑制活性高于单酶水解得到的产物。采用不同截留分子量的膜对水解液进行超滤分离，经截留分子量不同的膜分离后，分子量小于2000Da（UF-2）和分子量2000-6000Da（UC-2）组分对ACE的抑制率都很高，IC₅₀可以达到0.71 mg／mL和0.79 mg／mL，较未经超滤处理的水解原液来说有显著降低。考察了不同的水解条件对于多肽产率的影响，试验结果表明，温度因素对于多肽产率的影响最大，在温度55℃，pH值为

全文目录

前言  12-16
1 文献综述  16-45
  1.1 胶原蛋白  16-24
  1.2 水产胶原蛋白  24-27
  1.3 生物活性肽  27-36
  1.4 海洋生物活性肽  36-41
  1.5 胶原多肽  41-45
2 鱼皮胶原蛋白的提取及理化性质  45-57
  2.1 试验材料  45-46
  2.2 试验方法  46-49
    2.2.1 原料基本组成成分的测定  46
    2.2.2 原料鱼皮中胶原蛋白含量的测定  46-47
    2.2.3 鱼皮胶原蛋白的提取  47-48
    2.2.4 胶原蛋白理化性质的分析测定  48-49
  2.3 结果与讨论  49-56
    2.3.1 三种鱼皮的基本组成成分  49
    2.3.2 三种鱼皮中的胶原蛋白含量  49-50
    2.3.3 不同提取方法提取率的比较  50-51
    2.3.4 胶原蛋白纯度的测定  51
    2.3.5 胶原蛋白的理化性质  51-56
  2.4 结论  56-57
3 水解制备鱼皮胶原蛋白多肽及多肽的清除自由基活性  57-77
  3.1 材料与设备  58
  3.2 试验方法  58-63
    3.2.1 蛋白酶活力的测定  58-59
    3.2.2 鱼皮胶原蛋白水解工艺流程  59
    3.2.3 蛋白质回收率的测定  59-60
    3.2.4 蛋白质水解度的测定  60
    3.2.5 水解产物清除自由基能力的测定  60-61
    3.2.6 确定具有清除自由基活性的胶原多肽制备的最佳水解条件  61-62
    3.2.7 不同的酶解工艺条件对多肽产率的影响  62
    3.2.8 鱼皮胶原蛋白水解产物各超滤组分的清除自由基活性  62-63
    3.2.9 水解液分子量的测定  63
  3.3 结果与分析  63-75
    3.3.1 蛋白酶活力的测定  63-64
    3.3.2 最佳水解条件的确定  64-68
    3.3.3 不同酶解工艺对多肽产率的影响  68-71
    3.3.4 鱿鱼皮和鳕鱼皮胶原蛋白水解物超滤组分的清除自由基活性  71-74
    3.3.5 水解液分子量分布的研究  74-75
  3.4 讨论  75-76
  3.5 结论  76-77
4 鱼皮胶原蛋白抗衰老活性  77-85
  4.1 材料与设备  78
  4.2 试验方法  78-80
    4.2.1 动物的分组和饲养  78-79
    4.2.2 小鼠D-半乳糖亚急性衰老模型的建立及指标的测定  79
    4.2.3 统计学分析  79-80
  4.3 结果与分析  80-82
    4.3.1 小鼠血清中各生化指标的测定  80-81
    4.3.2 小鼠皮肤组织匀浆液中各生化制备的测定  81-82
  4.4 讨论  82-84
  4.5 结论  84-85
5 鱼皮胶原蛋白多肽的抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性  85-103
  5.1 材料与设备  86
  5.2 试验方法  86-90
    5.2.1 血管紧张素转换酶(ACE)的提取及酶活力的测定  86-87
    5.2.2 降血压肽抑制活性的体外检测方法  87-88
    5.2.3 半抑制浓度的测定  88
    5.2.4 确定制备ACE抑制肽的最佳水解条件  88-90
    5.2.5 不同的酶解工艺条件对多肽产率的影响  90
    5.2.6 鱼皮胶原蛋白水解产物各超滤组分的ACE抑制活性  90
    5.2.7 水解液分子量的测定  90
  5.3 结果与分析  90-100
    5.3.1 ACE活力测定  90-91
    5.3.2 确定制备ACE抑制肽的最佳水解条件  91-94
    5.3.3 不同的酶解工艺条件对水解度和ACE抑制肽产率的影响  94-97
    5.3.4 鱼皮胶原蛋白水解产物各超滤组分的ACE抑制活性的分析  97-98
    5.3.5 鱼皮胶原蛋白ACE抑制肽分子量分布的研究  98
    5.3.6 鱼皮胶原蛋白ACE抑制肽IC_(50)的测定  98-100
  5.4 讨论  100-103
6 鱼皮胶原蛋白多肽的慢性降压作用  103-109
  6.1 试验材料与仪器  104
  6.2 试验方法  104-105
    6.2.1 两肾一夹型肾血管高血压大鼠(RHR)模型的建立及分组  104
    6.2.2 血压的测定  104-105
    6.2.3 血管紧张素Ⅱ含量的测定  105
    6.2.4 统计学分析  105
  6.3 结果与分析  105-107
    6.3.1 酶解胶原蛋白多肽的慢性降压作用  105-106
    6.3.2 胶原蛋白多肽对大鼠血浆中AngⅡ水平的影响  106-107
  6.4 讨论  107-108
  6.5 结论  108-109
7 鱼皮胶原蛋白多肽对血管内皮细胞损伤的保护作用  109-114
  7.1 试验材料  109
  7.2 试验方法  109-110
  7.3 结果与分析  110-113
    7.3.1 胶原蛋白多肽预防给药对内皮细胞增殖的影响  110-111
    7.3.2 胶原蛋白多肽治疗给药对内皮细胞增殖的影响  111-113
  7.4 讨论  113-114
8 鱼皮胶原蛋白多肽抗肿瘤活性的测定  114-118
  8.1 试验材料  114
  8.2 试验方法  114-115
  8.3 结果与分析  115-117
    8.3.1 胶原蛋白多肽对小鼠淋巴白血病细胞P388的作用  115-116
    8.3.2 胶原蛋白多肽对人肺腺癌细胞A549的作用  116-117
  8.4 讨论  117-118
9 结论  118-121
参考文献  121-135
本论文的特色及创新之处  135-136
博士在读期间发表的文章  136-137
致谢  137

鱼皮胶原蛋白的制备及胶原蛋白多肽活性的研究

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