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人IL-2Rα链基因NRE结合蛋白的初步分离纯化及其编码基因筛选

作　者: 张玉建
导　师: 吴宁华；沈珝琲
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学
关键词: 博士学位论文医科大学抽提物结合蛋白报告基因结构域低亲和力受体白细胞介素协和淋巴细胞
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 1999年
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内容摘要

白细胞介素2（IL-2）和白细胞介素2受体（IL-2R）的相互作用在调节淋巴细胞免疫反应中起着关键作用。白细胞介素—2受体（IL—2R）由α、β、γ链所组成，依据对IL—2亲和力的不同，可分为三种形式：低亲和力受体只含有α链；中等亲和力受体含有β和γ链；高亲和力受体含有α、β和γ链。高亲和力IL—2R的出现和淋巴细胞增殖是受α链基因的诱导表达的控制，因此，α链基因的诱导表达是淋巴细胞获得对生理浓度IL—2完全反应能力所必需的。真核基因转录水平的表达调控是通过多种转录因子与基因的调控区的远端顺式作用元件及近端启动子的相互作用来完成的。IL—2Rα基因5′上游—471／+1bp的DNA片段含有IL—2Rα基因转录调控所需的主要顺式元件，在该区域内存在两个正调控区和一个负调控区。其中，负调控区（NRE）核心序列为TTCATCCCAGG（—391／-381bp）。本组曾发现IL—2Rα基因5′上游-153／-143bp之间有一序列（5′CCTGGTTTGAA 3′）为上游NRE核心序列的不完全反转重复序列（NIRS），同源性达到82％。通过荧光素酶报告基因活性检测发现在Jurkat细胞中只有当NRE和NIRS同时存在时才对IL—2Rα基因的转录起激活或抑制作用。通过紫外交联实验进一步发现在Jurkat细胞及HeLa细胞中均存在一种既能与NRE又能与NIRS结合的蛋白质。为了更好地了解IL-2Rα NRE特异结合蛋白（NRE-BP）的本质，我们分别对NRE-BP做了以下两方面的工作：一、应用肝素亲和层析对Jurkat细胞中IL-2Rα NRE-BP进行初步分离纯化首先为了跟踪检测NRE-BP，对凝胶迁移率变更分析（EMSA）反应的条件进行优化，建立了如下NRE-BP的EMSA反应体系：在20μL体系中，含有以下成分：20mmol／L HEPES-KOH pH7.9，150mmol／L KCl，2mmol／L EDTA，2mmol／LDTT，20-40μg/mL鲑精DNA，2％Ficoll，20％甘油，10⁴cpm ^32-p标记NRE探针（2-8×10⁸cpm／μg），2μg Jurkat细胞核抽提物或相应蛋白量的层析组分，在22℃保温45min后，用4％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（acrylamide：bisacrylamide为19：1）于4℃进行分离，80℃真空干胶后，放射自现显影48-72hr。

全文目录

英文缩写词表  4-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-17
材料与方法  17-39
  试剂与材料  17-18
  方法  18-39
结果  39-62
  第一部分  39-45
  第二部分  45-62
讨论  62-65
小结  65-66
参考文献  66-68
综述  68-92
致谢  92

人IL-2Rα链基因NRE结合蛋白的初步分离纯化及其编码基因筛选

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