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白桦木质素生物合成酶基因分离及遗传转化的研究

作　者: 刘雪梅
导　师: 杨传平；王秋玉
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 白桦 4CL CCoAOMT 基因转化烟草
分类号: S792.153
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 404次
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内容摘要

造纸业中常用的木浆原料包括针叶树和阔叶树,其中针叶树是最好的原料,但针叶树的生长缓慢,限制了在造纸业中的应用。要满足纸浆供应的需求,一个重要的途径是大量采用阔叶木。白桦是东北地区和黑龙江省的主要阔叶树种之一,其适应性和抗逆性较强,生长速度较快,纤维的长宽比(56.7)也适合造纸用。但树木中的木质素含量较高(针叶木为26-30%,阔叶木为23-30%),而木质素是导致造纸成本增加和严重环境污染的主要原因。因此,降低造纸原料中的木质素含量是源头治理造纸污染的新思路。本研究利用现代生物技术,分离白桦木质素生物合成相关酶CCoAOMT基因和4CL基因,并对CCoAOMT基因进行烟草木质素生物合成调控,研究其功能和调节机制。这会为通过降低造纸原料树种的木质素含量或改变其组分,培育白桦优良纸浆材新品种作一基础研究。木质素是植物体中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物质,在植物体中含量为15%-30%。木质素生物合成是一个多途径、有十多种酶参与的复杂的生化反应,咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶(CCoAOMT)和4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)是其中两个重要的酶。本研究第一项内容是应用RT-PCR技术从白桦分离出CCoAOMT基因和4CL基因的cDNA全长序列,分别为744bp和1629bp。BLASTN序列分析结果表明:与白桦CCoAOMT cDNA核苷酸序列同源性最高的是野草莓(Fragaria vesca),为88%,其次为葡萄(Vitis. vinifera),同源性为86%;与白桦4CL cDNA核苷酸序列同源性最高的是胡桃(Juglans. spp),同源性为85%,然后依次为悬钩子(Rubus. spp)为81%、紫穗槐(Amorpha fruticosa)为80%、苗栗野红豆(Glycine max L.)为79%和烟草(Nicotiana tabacum)为79%。BLASTP序列分析结果表明:与白桦CCoAOMT氨基酸序列同源性最高的是楮树(Broussonetia papyrifera),为92%,其次为颤杨(Populus tremuloides)和拟南芥(Arabidopsis thaliana),同源性均为91%;与白桦4CL氨基酸序列同源性最高的是悬钩子,为77%,其次是响毛杨(Populus tomentosa),为76%。利用DNA分析软件对多种植物CCoAOMT基因和4CL基因cDNA序列进行多序列比较,结果表明:(1)对于一对特定的两种植物,相同基因的氨基酸序列的同源百分率比核苷酸序列高;(2)基因序列(包括核苷酸序列和氨基酸序列)越长,同源百分率越低。白桦4CL基因核苷酸序列长为1629bp,和其它植物相比,同源百分率范围是58.2%—73.6%,CCoAOMT基因核苷酸序列长为744bp,同源

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
1 绪论  9-39
  1.1 木质素生物合成及其调控的研究进展  9-19
    1.1.1 木质素的种类和分布  9-10
    1.1.2 木质素的结构特征  10-11
    1.1.3 木质素生物合成途径  11-16
    1.1.4 木质素生物合成的基因调控  16-18
    1.1.5 问题与展望  18-19
  1.2 反义RNA技术研究进展  19-29
    1.2.1 反义RNA的发现  20
    1.2.2 反义RNA的含义  20-21
    1.2.3 反义RNA的基因调控作用和反义 RNA技术  21-23
    1.2.4 反义RNA的应用  23-29
  1.3 农杆菌介导高等植物基因转化的影响因素  29-36
    1.3.1 农杆菌转化的基本原理  29-30
    1.3.2 农杆菌转化系统的发展  30-31
    1.3.3 影响农杆菌介导植物基因转化的因素  31-36
    1.3.4 植物基因工程展望  36
  1.4 本研究的背景、内容和意义  36-39
2 实验材料与方法  39-54
  2.1 实验技术路线  39-41
    2.1.1 实验内容  39
    2.1.2 技术路线  39-41
  2.2 实验材料与方法  41-53
    2.2.1 白桦 CCoAOMT和4CL基因分离的材料与方法  41-46
    2.2.2 白桦CCoAOMT基因反义转化烟草的材料与方法  46-53
  2.3 本章小结  53-54
3 结果与分析  54-71
  3.1 白桦CCoAOMT和4CL基因CDNA全长的分离  54-64
    3.1.1 白桦CCoAOMT和4CL基因cDNA片段的获得和序列分析  54-57
    3.1.2 白桦CCOAOMT和4CL基因cDNA全长序列的获得  57-59
    3.1.3 白桦CCoAOMT和4CL基因cDNA全长的序列分析  59-64
  3.2 白桦CCoAOMT基因反义转化烟草  64-67
    3.2.1 白桦CCoAOMT基因反义表达载体的构建  64-65
    3.2.2 烟草叶片分化培养基的优化  65-66
    3.2.3 农杆菌介导的烟草叶盘法基因转化程序比较  66-67
  3.3 白桦CCoAOMT基因反义转化烟草结果检测  67-69
    3.3.1 烟草共培养叶片转基因苗的GUS检测  67
    3.3.2 转基因苗的GUS检测  67
    3.3.3 烟草转基因苗基因苗DNA的PCR检测  67-69
    3.3.3 烟草转基因苗的PCRSouthern检测  69
  3.4 本章小结  69-71
4 讨论与分析  71-86
  4.1 白桦CCoAOMT和4CL基因与其它植物的相似性分析  71-81
    4.1.1 白桦CCoAOMT基因与其它植物的相似性分析  71-72
    4.1.2 白桦4CL基因序列与其它植物的相似性分析  72-73
    4.1.3 不同植物CCoAOMT基因和4CL基因基因序列比较总结  73-81
  4.2 反义RNA技术的有效实施  81-82
    4.2.1 反义RNA技术的基本原理  81
    4.2.2 反义RNA靶序列的确定  81
    4.2.3 反义表达载体的有效构建  81-82
    4.2.4 反义RNA对相邻基因表达的影响  82
  4.3 影响烟草基因转化效率的因素  82-84
    4.3.1 基因转化中烟草不同分化培养基对转化效率的影响  82-83
    4.3.2 烟草叶片处理对转化后再生的影响  83
    4.3.3 转化过程对转化的影响  83-84
    4.3.4 选择培养对转化效率的影响  84
  4.4 本章小结  84-86
结论  86-88
参考文献  88-99
攻读学位期间发表的学术论文  99-100
致谢  100-102

白桦木质素生物合成酶基因分离及遗传转化的研究

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