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番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄LeJA2基因的功能研究

作　者: 刘媛媛
导　师: 张春庆
学　校: 山东农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 番茄组织培养基因转化茉莉酸信号传导系统抗性反应
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目前,杀虫剂和除草剂的大剂量应用对环境造成了很大的破坏,对人类的身体和生活质量也造成了不好的影响。高等植物在长期的进化过程中形成了复杂而精细的抗性反应机制以抵抗昆虫的侵害。深入认识植物对昆虫抗性的的分子机理将会为利用植物自身的抗性建立环境友好的控制农业害虫的策略提供理论依据。目前所鉴定的信号分子主要包括多肽信号分子系统素(Systemin)以及来源于不饱和脂肪酸的植物激素茉莉酸(JA),从分子水平对二者所介导的抗性反应过程进行遗传学解析,鉴定其中的重要组分(功能基因)并对其功能进行深入研究。本研究优化了番茄遗传转化体系;同时利用反向遗传学原理,构建了LeJA2(Lycopersicon es-culentum jasmonic acid 2)的过量表达载体和RNAi表达载体,通过农杆菌介导的转基因技术,获得两种类型的转基因苗,通过对两种类型的转基因苗的性状鉴定和PPO活性的测定,对LeJA2的功能进行了初步的预测。主要研究的结果如下:1.建立了农杆菌介导的番茄遗传转化体系对农杆菌介导的番茄转化LeJA2基因系统进行了优化,研究了农杆菌侵染时间、侵染温度和侵染浓度三个因素对番茄愈伤组织形成的影响,寻求影响基因转化的主要因素,获得了较好的番茄农杆菌侵染体系。2.获得了转基因番茄植株以子叶为转化受体,使用高效农杆菌介导遗传转化体系将LeJA2基因和LeJA2-RANi基因导入番茄,获得了20株LeJA2过量表达的番茄抗性植株和35株LeJA2基因沉默抗性植株,PCR检测结果表明卡那抗性株均能扩增出1050和517bp的目的条带,证明基因已经整合到番茄基因组中。3.功能验证对转基因番茄植株PPO活性进行了初步检测。通过PPO活性测定结果得出:植株机械损伤处理前,过量表达LeJA2基因的转基因植株PPO染色后呈现深褐色,而对照和转LeJA2-RNAi基因植株PPO染色后仍然呈现正常的汁液的绿色。用剪刀进行机械损伤后进行PPO染色,LeJA2基因过量表达植株、转LeJA2-RANi基因植株和对照染色后都呈现深褐色。试验结果表明LeJA2基因在番茄茉莉酸介导的伤信号传导途径中起着上游调控的作用,调控着抗性相关基因的表达。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
1 前言  13-31
  1.1 番茄系统创伤信号因子研究进展  13-14
  1.2 植物伤害信号途径  14-21
    1.2.1 伤害信号的种类  15-16
      1.2.1.1 系统素(systemin)  15
      1.2.1.2 物理信号  15
      1.2.1.3 活性氧  15
      1.2.1.4 一氧化氮(NO)  15-16
      1.2.1.5 寡聚半乳糖醛酸  16
    1.2.2 伤害反应中的植物激素  16-18
      1.2.2.1 茉莉酸(Jasmonic acid, JA)  16-17
      1.2.2.2 乙烯(ethylene,ET)  17
      1.2.2.3 水杨酸(salicylic acid,SA)  17
      1.2.2.4 脱落酸(abscisic acid,ABA)  17
      1.2.2.5 生长素(Auxin)  17-18
    1.2.3 伤害诱导的细胞内变化  18-21
      1.2.3.1 伤害和离子浓度的改变  18
      1.2.3.2 伤害诱导磷脂酶活性变化  18-19
      1.2.3.3 伤害引起CaM m RNA 积累  19
      1.2.3.4 伤害诱导蛋白磷酸化与去磷酸化活性变化  19-20
        1.2.3.4.1 CDPK  19-20
        1.2.3.4.2 MAPK  20
      1.2.3.5 蛋白磷酸酶  20-21
    1.2.4 伤害诱导的防御基因  21
    1.2.5 伤害诱导信号传导模式  21
  1.3 茉莉酸抗性反应系统的研究  21-27
    1.3.1 茉莉酸的研究  22-23
    1.3.2 植物内源茉莉酸类化合物合成途径  23-25
    1.3.3 番茄中信号传导途径的研究  25-27
  1.4 番茄茉莉酸代谢相关基因克隆及功能分析  27-30
  1.5 本课题研究的目的意义  30-31
2 材料和方法  31-41
  2.1 实验材料  31-32
    2.1.1 植物材料  31
    2.1.2 菌株  31
    2.1.3 质粒  31-32
    2.1.4 主要试剂  32
    2.1.5 主要仪器  32
    2.1.6 PCR 扩增引物  32
  2.2 主要试剂  32-35
    2.2.1 培养基的配制  32-33
      2.2.1.1 细菌培养基  32-33
      2.2.1.2 植物培养基  33
    2.2.2 常用的缓冲液和试剂成分的配制  33-35
      2.2.2.1 质粒DNA 提取及纯化所用的试剂  33
      2.2.2.2 DNA 提取所用的试剂  33
      2.2.2.3 电泳所用的试剂  33-34
      2.2.2.4 PPO 活性检测所用的试剂  34
      2.2.2.5 PPO 活力测定所用的试剂  34
      2.2.2.6 其他试剂  34-35
  2.3 实验方法  35-40
    2.3.1 番茄遗传转化体系的优化  35
      2.3.1.1 试验采取的处理和水平  35
    2.3.2 SDS 碱裂解法少量快速制备质粒DNA  35-36
      2.3.2.1 质粒检测  36
    2.3.3 番茄遗传转化  36-38
      2.3.3.1 种植无菌苗  36
      2.3.3.2 外植体的准备  36-37
      2.3.3.3 农杆菌介导的转化  37
      2.3.3.4 抗性愈伤筛选  37-38
      2.3.3.5 抗性芽的生根  38
    2.3.4 转基因植株的分子检测  38-40
      2.3.4.1 番茄基因组DNA 的提取参考Li et al.(2006)所描述  38-39
      2.3.4.2 PCR 扩增分析  39-40
    2.3.5 两种类型转基因苗的性状鉴定  40
    2.3.6 转基因植株多酚氧化酶PPO 活性的测定  40
      2.3.6.1 试验方法  40
      2.3.6.2 实验设计  40
  2.4 计算公式  40-41
3 实验结果与分析  41-53
  3.1 质粒检测  41
  3.2 番茄遗传转化体系的优化  41-46
    3.2.1 番茄转基因植株的获得  43-46
    3.2.2 番茄基因转化结果  46
  3.3 转基因番茄植株的分子生物学鉴定  46-48
  3.4 T0 代转基因苗的性状观测  48-50
  3.5 转基因植株多酚氧化酶（PPO）活性检测  50-53
4 讨论  53-57
  4.1 番茄农杆菌介导体系的优化  53-54
    4.1.1 组织培养过程中注意事项  53-54
  4.2 转基因植株的PPO 活性测定  54-55
  4.3 LeJA2 基因的BLAST 同源序列分析  55-57
5 结论  57-59
  5.1 番茄转化系统的优化  57
  5.2 番茄基因转化结果  57
  5.3 LeJA2 基因功能分析  57-59
参考文献  59-73
附录1：常用培养基配方  73-75
附录2 LeJA2 基因用于转基因的片段  75-78
附录3  78-79
致谢  79-80

番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄LeJA2基因的功能研究

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