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棉花转GST基因恢复系恢复力提高机理的研究

作　者: 朱云国
导　师: 王学德
学　校: 浙江大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花杂种优势细胞质雄性不育转基因恢复系线粒体活性氧谷胱甘肽S转移酶
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

棉花具有十分明显的杂种优势,种植杂交棉是提高棉花产量和品质的有效途径之一。目前棉花杂种种子主要是通过“人工去雄授粉法”获得,制种成本高,效率低,有碍棉花杂种优势的利用。棉花细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility,CMS）植株自身不能产生有生活力的花粉,而雌蕊正常可育。利用棉花细胞质雄性不育的“三系”和蜜蜂传粉的制种法,可省去人工“去雄”和“授粉”,从而大大降低棉花杂种种子的生产成本,在棉花杂种优势利用中具有重要价值。早在二十世纪70年代,美国的Meyer（1973）已育成具有哈克尼西棉（G.harknessii Brandegee）细胞质的雄性不育系,并实现了“三系”配套,但因其恢复系“DES-HAF277”的恢复力不够强,故在生产上一直未被利用。王学德用转基因技术将谷胱甘肽S转移酶（Glutathione S-Transferase,GST）基因parB（GeneBank序列号D10524）导入到恢复系中,培育出了一个强恢复系——“浙大强恢”。与受体恢复系“DES-HAF277”相比,“浙大强恢”对不育系的恢复力提高了25.8%,解决了棉花细胞质雄性不育“三系”中恢复系对不育系育性恢复力不够强的问题,从而使通过“三系法”制种大面积利用棉花杂种优势成为可能,故在生产上有广阔的应用前景。但棉花转GST基因恢复系恢复力提高的具体机理并不清楚。为此,本文以哈克尼西棉细胞质不育系和保持系为对照,以转基因恢复系“浙大强恢”所配F₁和受体恢复系“DES-HAF277”所配F₁为材料,通过田间考察和比较试验,研究外源GST基因parB对杂种F₁花药、胚珠、产量和品质性状的效应;通过石蜡切片光学显微镜观察和超薄切片电子显微镜观察,研究外源GST基因parB对杂种F₁花药显微和超微结构的影响;通过生化分析,研究外源GST基因parB对杂种F₁花药及其线粒体呼吸和活性氧代谢的影响;采用实时荧光相对定量PCR的方法,研究外源GST基因parB在杂种F₁的转录情况及其与GST酶活性的关系。研究主要结果如下: 哈克尼西棉细胞质雄性不育系花药及其线粒体O₂^-的产生速率明显高于正常,远远超出活性氧清除体系的清除能力,从而引起大量的活性氧积累,造成氧应激,使雄性细胞及其线粒体发生严重的膜脂过氧化,进而造成雄性细胞的退化。反映在细胞形态学上,造孢细胞增殖期,不育系雄性细胞线粒体最先出现异常,表现为部分线粒体出现肿胀、内嵴开始模糊、基质变淡;接着,它们的细胞质开始收缩,细胞膜局部与细胞壁分离,细胞质内核糖体密度下降;随着肿胀线粒体数目的增加和线粒体肿胀程度的加深,雄性细胞的液泡膜出现破裂,液泡对细胞质及其中的细胞器进行自吞噬,染色质发生凝缩,内质网膨大;然后,雄性细胞整个结构被破坏,细胞质和细胞核逐渐解体、消失。这些败育的超微结构,同文献报道的活性氧诱导的植物细胞程序性死亡的超微结构十分相似。所以认为,哈克尼西棉细胞质雄性不育系雄性细胞的败育是一个由过量活性氧诱导的细胞程序性死亡的过程。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表  11-12
第一章文献综述  12-33
  1 棉花杂种优势的表现及其利用  12-14
    1．1 棉花杂种优势的表现  12-13
    1．2 棉花杂种优势的利用  13-14
  2 棉花细胞质雄性不育的研究和利用  14-26
    2．1 植物细胞质雄性不育机理研究的概况  14-24
    2．2 棉花细胞质雄性不育的研究概况  24-26
  3 棉花转GST基因恢复系的选育  26-33
    3．1 GST酶简介  26-29
    3．2 GST基因简介  29-30
    3．3 棉花转GST基因恢复系的选育过程及其意义  30-33
第二章外源GST基因对杂种F_1农艺性状的效应  33-45
  1 材料与方法  33-35
    1．1 材料  33
    1．2 方法  33-35
  2 结果与分析  35-43
    2．1 外源GST基因对杂种F_1花器和花药性状的效应  35-36
    2．2 外源GST基因对杂种F_1花粉育性的效应  36-38
    2．3 外源GST基因对杂种F_1胚囊育性的效应  38-39
    2．4 外源GST基因对杂种F_1产量和纤维品质性状的效应  39-40
    2．5 2个恢复系主要农艺性状一般配合力的比较  40-43
    2．6 蜜蜂媒介传粉“三系法”制种的效果  43
  3 讨论  43-45
第三章外源GST基因对杂种F1花药显微结构的影响  45-53
  1 材料与方法  45-46
    1．1 材料  45
    1．2 方法  45-46
  2 结果与分析  46-48
    2．1 外源GST基因对杂种F_1小孢子发生和雄配子形成显微结构的影响  46-48
    2．2 外源GST基因对杂种F_1花药绒毡层发育显微结构的影响  48
  3 讨论  48-53
第四章外源GST基因对杂种F_1花药超微结构的影响  53-67
  1 材料与方法  53-54
    1．1 材料  53
    1．2 方法  53-54
  2 结果与分析  54-58
    2．1 外源GST基因对杂种F_1小孢子发生和雄配子形成超微结构的影响  54-55
    2．2 外源GST基因对杂种F_1花药绒毡层发育超微结构的影响  55-56
    2．3 外源GST基因对杂种F_1线粒体超微结构的影响  56-58
  3 讨论  58-67
第五章外源GST基因对杂种F_1呼吸和活性氧代谢的影响  67-97
  1 材料与方法  67-69
    1．1 材料  67-68
    1．2 方法  68-69
  2 结果与分析  69-93
    2．1 外源GST基因对杂种F_1花药及其线粒体总呼吸速率和抗氰呼吸的影响  69-73
    2．2 外源GST基因对杂种F_1花药及其线粒体O_2~-的产生速率、H_2O_2和MDA含量的影响  73-78
    2．3 外源GST基因对杂种F_1花药线粒体SOD、APX、GR、DHAR和GST活性的影响  78-82
    2．4 外源GST基因对杂种F_1花药线粒体中谷胱甘肽和抗坏血酸含量的影响  82-87
    2．5 外源GST基因对杂种F_1花药SOD、POD、CAT、APX和GST活性的影响  87-91
    2．6 外源GST基因对杂种F_1花药可溶性蛋白含量的影响  91-92
    2．7 外源GST基因对杂种F_1花药总DNA琼脂糖电泳的影响  92-93
  3 讨论  93-97
    3．1 植物细胞内的活性氧代谢  93-94
    3．2 活性氧积累导致雄性细胞败育  94-95
    3．3 外源GST基因能防止活性氧积累  95-97
第六章外源和内源GST基因的转录特征  97-109
  1 材料与方法  97-99
    1．1 材料  97
    1．2 方法  97-99
  2 结果与分析  99-105
    2．1 总RNA的提取质量  99
    2．2 引物设计的质量  99-101
    2．3 外源和内源GST基因的转录特征  101-105
  3 讨论  105-109
第七章总结与展望  109-122
  1 总结  109-119
    1．1 线粒体缺陷导致CMS  109-110
    1．2 哈克尼西棉细胞质雄性不育机理  110-113
    1．3 受体恢复系恢复力不够强的原因  113-116
    1．4 转GST基因恢复系恢复力提高的机理  116-118
    1．5 棉花转GST基因恢复系选育的意义  118-119
  2 进一步研究的设想  119-122
参考文献  122-129
博士期间发表的论文及论著  129

棉花转GST基因恢复系恢复力提高机理的研究

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