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心钠肽对猪卵母细胞成熟、受精和大熊猫精子功能的影响
作 者: 张美佳
导 师: 夏国良
学 校: 中国农业大学
专 业: 生理学
关键词: 心钠肽 卵母细胞减数分裂 精子 信号转导 反转录聚合酶链式反应
分类号: Q954.43
类 型: 博士论文
年 份: 2005年
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内容摘要
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心钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)主要由心脏分泌的一种小肽类激素,参与了血压调节和机体内环境的动态平衡。近年来研究发现ANP及其受体在哺乳动物卵巢和输卵管中广泛存在。一般认为促性腺激素通过cAMP信使促进卵母细胞的成熟。现在研究表明cGMP也参与卵母细胞的成熟和精子顶体反应。ANP可与受体结合,激活粒性鸟苷酸环化酶,使cGMP水平上升,从而可能在生殖系统中具有重要的生理作用。本文以猪和大熊猫为对象,研究了ANP在卵母细胞成熟和精子功能中的作用及机理。 实验一研究了ANP对猪卵丘细胞包被的卵母细胞(cumulus-enclosed oocytes,CEOs)体外成熟和卵丘扩散的影响。当猪CEOs在添加有卵泡液的培养液中培养时,ANP剂量依赖性负调节FSH诱导的生发泡破裂(在FSH,FSH+10 nM ANP和FSH+1μM ANP处理组中的GVBD分别为:90.1:81.2和68.2%),第一极体排出(在FSH,FSH+1nM ANP和FSH+1μM ANP处理组中的PB1分别为86.1;75.3和53.3%)和卵丘扩散(在FSH,FSH+1nM ANP和FSH+1μM ANP处理组中的卵丘扩散指数分别为3.47;3.16和2.43)。该影响也表现出时间依赖性。当猪CEOs培养在无卵泡液的培养液中时,ANP显著抑制FSH诱导的GVBD(47.6%vs.83.8%)和IPB1的排出(22.4%vs.45.2%).cGMP类似物8-Br-cGMP(10μM-1 mM)可模拟ANP对GVBD、PB1和卵丘扩散的影响。ANP的作用可完全被cGMP依赖性的蛋白激酶(PKG)抑制剂KT5823所抑制,而与ANP受体C特异结合的C-ANP-(4-23)对卵母细胞体外成熟没有影响。ANP和C-ANP-(4-23)对猪卵母细胞自发成熟没有影响。这些结果表明,ANP负调节FSH诱导的猪卵母细胞减数分裂恢复、减数分裂成熟和卵丘扩散。ANP对卵母细胞成熟的影响是通过cGMP依赖性的蛋白激酶(PKG)实现的。 实验二重点研究了ANP在猪卵母细胞成熟过程中的作用机制。结果表明ANP能抑制FSH诱导的猪卵母细胞成熟和卵丘扩散,并阻止卵母细胞和卵丘细胞中有丝分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的完全磷酸化。ANP的抑制作用可被8-Br-cGMP模拟,而蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)抑制剂KT5823却能完全逆转。扎普司特(zaprinast)(cGMP特异的磷酸二酯酶抑制剂)能增强ANP在卵母细胞成熟中的作用。C-ANP-(4-23)(特异地与钠肽受体C(NPRC)结合的类似物)对FSH诱导的和自发的猪卵母细胞成熟没有影响。用毛喉素(forskolin,一种腺苷酸环化酶激动剂)培养猪卵母细胞得到两种不同的结果:培养44h可诱导卵丘扩散但抑制卵丘包被的卵母细胞(cumulus-enclosed oocytes,CEOs)成熟,而培养2h可诱导卵母细胞成熟。ANP和C-ANP-(4-23)都能抑制forskolin对CEOs的成熟影响,而其抑制作用百日咳毒素(pertussis toxin,PT)阻止,表明ANP和C-ANP-(4-23)对forskolin的抑制作用是通过调节卵丘细胞上的Gi蛋白实现的。所有这些结果表明ANP通过两种不同的信号机制调节FSH和forskolin在猪卵母细胞成熟中的作用:一是通过cGMP/PKG通路,另外一种是通过卵丘细胞上的NPRC受体,并激活PT敏感的Gi蛋白通路。 实验三研究了ANP及其受体在猪精子和输卵管中的表达以及其ANP对猪精子功能的影响。RT-PCR分析表明,精子中仅存在钠肽受体A(natriuretic peptide receptors-A,NPRA)基因的表达。ANP mRNA水平在输卵管1期(OT1)、3期(OT3)和5期(OT5)中较高,在2期(OT2)中较低。NPRA mRNA水平在OT1和OT2期较低,OT3期开始上升,到OT4、OT5期达到最高。ANP能诱导猪精子发生顶体反应。当用1nM ANP处理时,其诱导顶体反应的百分率最高(34.1±2.3%)。C-ANP-(4-23)和咖啡因都对猪精子的顶体反应没有影响。ANP对精子顶体反应的影响
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全文目录
中文摘要 5-7
英文摘要 7-14
英文缩写中文对照 14-16
第一篇 文献综述 16-60
第一章 钠肽系统 16-24
1 钠肽家族 16-17
2 钠肽结构 17-20
3 钠肽受体 20
4 钠肽体系在动植物中的分布 20-21
4.1 脊椎动物中的钠肽 20-21
4.2 脊椎动物中的钠肽受体 21
4.3 无脊椎动物和植物中的钠肽系统 21
5 钠肽的生物学功能 21-22
6 钠肽分泌的调节 22-24
第二章 ANP的生理功能及其作用机制 24-37
1 ANP分泌细胞的形态结构及其分布特征 25
2 ANP的分子生物学特性 25-26
3 ANP的生物学功能 26-30
3.1 ANP在循环系统中的作用 26-27
3.2 ANP在泌尿系统中的作用 27
3.3 ANP在呼吸系统中的作用 27-28
3.4 ANP在内分泌系统中的作用 28-29
3.5 ANP在神经系统中的作用 29
3.6 ANP在免疫系统的作用 29
3.7 其它作用 29-30
4 ANP的作用机制 30-33
4.1 NPRA／cGMP信号通路 31-32
4.2 NPRC／Gi蛋白信号通路 32-33
5 ANP与一氧化氮(NO)的关系 33-35
5.1 ANP对NO的调节 33-34
5.2 NO对ANP的调节 34-35
6 ANP在临床治疗中的作用 35-37
6.1 血浆ANP的含量可作为某些疾病的诊断指标 35-36
6.2 ANP在疾病治疗中的应用 36-37
第三章 ANP在雌性生殖系统中的作用 37-46
1 ANP对卵巢功能的调节 37-41
1.1 cGMP依赖的信号通路在卵巢中的生理功能 37-38
1.2 卵巢表达钠肽及其受体鸟苷酸环化酶 38
1.3 NO／cGMP对卵巢功能的影响 38-40
1.4 cGMP的作用机制 40-41
1.5 卵巢自分泌／旁分泌因子通过NO／cGMP起作用 41
2 ANP对卵母细胞成熟的影响 41-45
2.1 ANP存在于卵母细胞中 41-43
2.2 ANP对卵母细胞成熟的影响 43-44
2.3 ANP的作用机制 44-45
2.4 其它激素对ANP的调节 45
3 ANP在输卵管中的作用 45-46
第四章 ANP在雄性生殖系统中的作用 46-53
1 ANP在雄性生殖系统中的分布 46-47
2 ANP对精子功能的影响 47-52
2.1 ANP对精子的趋化作用 47-51
2.2 ANP诱导精子顶体反应 51-52
3 其它作用 52-53
第五章 其它钠肽的存在部位及其功能 53-60
1 BNP的存在部位及其功能 53-55
1.1 BNP的结构 53-54
1.2 BNP的合成和释放 54
1.3 BNP的生理作用 54-55
2 CNP的存在部位及其功能 55-58
2.1 CNP的存在部位 55
2.2 CNP的生理功能 55-58
3 DNP存在部位及其功能 58-60
第二篇 研究论文 60-113
引言 60-61
第一章 ANP通过PKG信号通路负调节FSH诱导的猪卵母细胞成熟和卵丘扩散 61-73
1 引言 61-62
2 材料与方法 62-64
2.1 试剂 62
2.2 猪卵母细胞采集 62-63
2.3 卵母细胞的体外成熟 63
2.4 卵丘扩展的评判和分级 63
2.5 卵母细胞核相检查 63
2.6 实验设计 63-64
2.7 统计分析 64
3 结果 64-70
3.1 ANP对FSH诱导的猪卵母细胞成熟和卵丘扩散的影响 64
3.2 8-Br-cGMP对FSH诱导的猪卵母细胞成熟和卵丘扩散的影响 64-68
3.3 C-ANP-(4-23)和KT5823对ANP在卵母细胞成熟作用中的影响 68
3.4 ANP和C-ANP-(4-23)对猪卵母细胞自发成熟和／或卵丘扩散的影响 68
3.5 ANP对培养在无pFF培养液中的猪卵母细胞成熟的影响 68-70
4 讨论 70-73
第二章 ANP通过不同的信号通路抑制FSH和forskolin在猪卵母细胞减数分裂成熟中的作用 73-87
1 引言 73-74
2 材料与方法 74-76
2.1 试剂 74-75
2.2 猪卵母细胞收集 75
2.3 卵母细胞的体外培养 75
2.4 卵丘扩展的评判和分级 75
2.5 卵母细胞的形态学观察和核相检测 75
2.6 免疫蛋白印迹 75-76
2.7 实验设计 76
2.8 统计分析 76
3 结果 76-84
3.1 ANP抑制FSH诱导的猪CEOs减数分裂恢复和第一次减数分裂的成熟 76-77
3.2 ANP抑制FSH诱导的MAPK磷酸化 77-79
3.3 ANP和C-ANP-(4-23)抑制forskolin在猪CEOs减数分裂恢复和第一次减数分裂成熟的作用 79-81
3.4 ANP利C-ANP-(4-23)对猪裸卵母细胞成熟的影响 81-82
3.5 ANP对猪卵丘扩散的影响 82-83
3.6 Gqa(G_(11)a)抗体对FSH诱导的CEOs成熟的影响 83-84
4 讨论 84-87
第三章 ANP基因表达及其对猪精子功能的影响 87-102
1 引言 87-88
2 材料与方法 88-91
2.1 试剂和培养液 88
2.2 RNA的提取及RT-PCR 88-89
2.3 精液准备和顶体反应评估 89
2.4 猪卵母细胞收集与培养 89-90
2.5 体外受精和胚胎培养 90
2.6 实验设计 90-91
2.7 统计分析 91
3 结果 91-100
3.1 猪精子和输卵管中ANP基因、NPRA基因和NPRC基因的表达 91-96
3.2 ANP诱导猪精子发生顶体反应 96
3.3 8-Br-cGMP对猪精子发生顶体反应的影响 96
3.4 KT5823对ANP诱导的精子顶体反应的影响 96-99
3.5 ANP增强猪精子的受精能力 99-100
4 讨论 100-102
第四章 ANP诱导大熊猫精子顶体反应以及增强它们穿透盐溶液固定后的猪卵母细胞的能力 102-112
1 引言 102-103
2 材料与方法 103-106
2.1 试剂和培养液 103
2.2 精液采集和冷冻 103-105
2.3 精液准备和顶体反应评估 105
2.4 卵母细胞准备和盐溶液固定 105
2.5 透明带穿透分析 105-106
2.6 卵母细胞评估 106
2.7 实验设计 106
2.8 统计分析 106
3 结果 106-109
3.1 精液生理特征 106-107
3.2 ANP对新鲜精子顶体反应的影响 107-108
3.3 KT5823对ANP诱导精子发生顶体反应中的影响 108
3.4 ANP对冷冻精液顶体反应的影响 108
3.5 ANP、咖啡因和肝素对精子穿卵的影响 108-109
4 讨论 109-112
第五章 结论 112-113
参考文献 113-141
致谢 141-142
个人简介 142-143
博士和工作期间已发表和待发表的论文 143-144
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中图分类: > 生物科学 > 动物学 > 动物形态学 > 动物胚胎学（动物发生学、动物胎生学） > 生殖细胞（配偶子）
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