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军曹鱼与红鳍笛鲷精液超低温保存及冷冻损伤研究

作　者: 邓普恩
导　师: 刘楚吾
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 精子超低温冷冻人工授精单细胞电泳技术低渗肿胀技术
分类号: S961.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近年来,海水鱼类繁养殖产业得到了迅猛发展,但是种质资源退化也日趋严重,由此而来种质资源保存显得尤为重要。精子冷冻保存技术作为保存种质细胞的一种方法理应发挥其应有的作用。一直以来,鱼类精子冷冻保存研究主要在实验阶段,由于物种及个体之间精子冻后成活率存在差异,很难找到一个通用的精子超低温冷冻保存方法,同时对冷冻损伤的机理也了解不多。本研究对军曹鱼与红鳍笛鲷精液超低温保存及冷冻损伤进行了研究,其主要内容概要如下:1.在军曹鱼与红鳍笛鲷新鲜精子活力观察中,通过新鲜精液精子激活与新鲜精液常温保存,观察精子活力保持时间与精子室温保存时间,以及通过测算获得精子的大小及浓度等数据。结果表明,新鲜精液激活后,军曹鱼精子保持活力要比红鳍笛鲷精子稍微长一些,但两者没有显著性差异(P>0.05),最佳的活力都在3 min之内,3 min以后活力都迅速下降。在室温保存新鲜精子的实验中,军曹鱼与红鳍笛鲷精子室温保存30 min是两者在室温状态下较好的保存时间,在这时间内活力较高,适合用于生产实践和精子实验研究中。2.通过对基础液、抗冻剂、降温程序、稀释比例及冷冻体积等超低温冷冻条件以及解冻方法的筛选,最后经冷冻精液活力观察与人工授精实验得到军曹鱼与红鳍笛鲷精子最佳冷冻方案及复活方法。结果表明基础液、抗冻剂种类与浓度及降温程序是影响精子冷冻保存成功的三大关键因素,对精子活力、受精率及出膜率的影响较大,其次为精子稀释比例、保存体积及解冻方法。就超低温冷冻精子的出膜率、受精率及精子活力而言,军曹鱼精子最佳超低温冷冻方案:采用MPRS+12%甘油或DPE+10%甘油作为稀释液;稀释比例为1:50;冷冻体积为0.5 mL;冷冻程序:25℃至-20℃,-10℃/min、-20℃处平衡5 min、-20℃至-80℃,-10℃/min、-80℃处平衡5 min后直接放入液氮;37℃恒温水浴解冻后的精子活力最高可达90%以上,受精率、达原肠胚率和出膜率可达50%以上。红鳍笛鲷精子最佳超低温冷冻方案:采用HBSS+10%甘油作为稀释液;稀释比例为1:50;冷冻体积为0.5 mL;冷冻程序:25℃至-20℃,-10℃/min、-20℃处平衡5 min、-20℃至-80℃,-10℃/min、-80℃处平衡5 min后直接放入液氮;37℃恒温水浴解冻后的精子活力最高可达85%以上,受精率可达80%以上、达原肠胚率和出膜率可达60%以上。3.运用单细胞电泳技术对军曹鱼与红鳍笛鲷超低温冷冻保存的精子进行精子细胞核冷冻损伤分析。将精子电泳图谱转化为数据,分析得到10%的抗冻剂甘油对军曹鱼与红鳍笛鲷精子的保护效果较好。同时发现,不同的降温方法是造成精子DNA损伤的最大因素。在彗星率与受精率的相互关系中发现两者的线性相关性不明显,可能与受精率在受精过程中受到诸多因素影响有关。4.采用低渗肿胀技术对军曹鱼与红鳍笛鲷超低温冷冻保存的精子进行细胞膜完整性以及精子断尾损伤情况研究。结果显示:精子细胞膜完整性以及精子断尾损伤主要是由不同的降温方法所致,精子细胞内结晶时间越长损伤越严重。

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摘要 6-8Abstract 8-131 绪论 13-26 1.1 研究对象介绍 13-14 1.1.1 军曹鱼 13 1.1.2 红鳍笛鲷 13-14 1.2 鱼类精子超低温冷冻保存及冷冻损伤研究概况 14-22 1.2.1 精子超低温冷冻保存的目的与意义 15 1.2.2 精子超低温冷冻保存与损伤原理及保存方法 15-18 1.2.3 稀释液成分研究 18-19 1.2.4 降温方法、解冻方法及保存方法对低温冷冻保存效果的影响 19 1.2.5 影响精子质量的因素及对冷冻保存效果的影响 19-20 1.2.6 精子质量评价体系 20-21 1.2.7 鱼类精液超低温冷冻保存的损伤研究 21-22 1.2.8 鱼类精子超低温冷冻保存研究的主要成果 22 1.3 鱼类精子超低温冷冻保存中存在的问题及前景展望 22-24 1.3.1 存在的问题 22-23 1.3.2 前景展望 23-24 1.4 本研究的目的与意义 24-262 军曹鱼与红鳍笛鲷新鲜精子形态与活力观察 26-34 2.1. 实验材料 26-28 2.1.1 亲鱼来源 26 2.1.2 主要仪器 26-27 2.1.3 试剂 27-28 2.2 实验方法 28-29 2.2.1 精子采集 28 2.2.2 精子形态观察 28 2.2.3 新鲜精子活力评价 28 2.2.4 数据处理 28-29 2.3 实验结果与分析 29-33 2.3.1 精子形态观察 29-30 2.3.2 新鲜精子浓度与活力观察 30-33 2.4 讨论 33-343 军曹鱼与红鳍笛鲷精子超低温冷冻保存研究 34-60 3.1. 实验材料 34 3.1.1 亲鱼来源 34 3.1.2 主要仪器 34 3.1.3 试剂 34 3.2 实验方法 34-38 3.2.1 配子采集 34 3.2.2 精子活力检测 34 3.2.3 精子超低温冷冻 34-37 3.2.4 解冻方法对冷冻精子活力的影响 37 3.2.5 冷冻精液人工授精 37-38 3.2.6 数据处理 38 3.3 实验结果与分析 38-56 3.3.1 精子超低温冷冻保存 38-47 3.3.2 解冻方法对冷冻精子活力的影响 47-48 3.3.3 冷冻精子人工授精 48-56 3.4 讨论 56-60 3.4.1 超低温冷冻及解冻方法筛选 56-58 3.4.2 受精实验 58-604 单细胞电泳技术检测超低温冷冻对军曹鱼与红鳍笛鲷精子DNA 的损伤 60-68 4.1. 实验材料 60 4.1.1 精子来源 60 4.1.2 主要仪器 60 4.1.3 试剂 60 4.2 实验方法 60-62 4.2.1 精子处理 60-61 4.2.2 制片 61 4.2.3 精子裂解 61 4.2.4 电泳 61 4.2.5 中和 61 4.2.6 染色和观察 61 4.2.7 精子DNA 的损伤分级 61 4.2.8 数据处理 61-62 4.3 实验结果 62-66 4.4 讨论 66-685 低渗肿胀技术检测超低温冷冻对军曹鱼与红鳍笛鲷精子细胞膜的损伤 68-75 5.1 实验材料 68 5.1.1 精子来源 68 5.1.2 主要仪器 68 5.1.3 试剂 68 5.2 实验方法 68-69 5.2.1 精子处理 68 5.2.2 低渗液浓度的筛选 68-69 5.2.3 低渗肿胀实验 69 5.2.4 数据处理 69 5.3 实验结果 69-73 5.4 讨论 73-756 结论 75-77参考文献 77-87附录Ⅰ：受精发育过程 87-90附录Ⅱ：单细胞电泳 90-91附录Ⅲ：实验掠影 91-93致谢 93-94作者简介 94-95导师简介 95

军曹鱼与红鳍笛鲷精液超低温保存及冷冻损伤研究

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