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树突状细胞抗原递呈功能及其结构基础的研究

作　者: 潘春华
导　师: 罗荣城
学　校: 第一军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: DC细胞抗原递呈功能树突状细胞结构基础 CD分子 T细胞 CD45RA 共聚焦显微镜 CD45RO CD11c
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

一．研究目的：本研究的拟建立成熟的、功能良好的DC细胞的培养体系，即：DC细胞形态典型、表达特征性的CD分子、能够诱导T淋巴细胞活化、增殖、亚群分化、分泌特征性细胞因子；研究DC细胞的超微结构并在纳米级水平上做进一步结构分析，用荧光探针寻找DC细胞成熟标志的CD分子（CD83、CD1a）、第二信号CD分子（CD86、CD80）和代表亚群来源的CD11c分子的表达位置，推测免疫应答的发生部位；观察免疫应答时DC细胞与T淋巴细胞的相互作用、形态学变化和Ca2+的动态变化。二、材料和方法：（一）主要试剂和设备： 1．试剂： AIM-V培养基、rhGM-CSF、rhIL-4、小鼠抗人FITC标记的CD86、HLA-DR、CD11c、Lin-1、CD4、IgG2a、CD45RA、CD69、Lin-1及小鼠抗人PE标记的CD83、CD86、CD80、CD3、CD123、CD40、CD4、CD25、CD28、CD45RO、IFN-γ和IL-4；小鼠抗人CD4-APC、CD8PE—Cy5、HLA-DR-percp、Mouse IgGl-PE和Mouse IgGl-FITC的MoAb；Annexin V-FITC／PⅠ双染法流式细胞分析试剂盒。 2．设备：二氧化碳电热恒温箱、流式细胞仪、Nikon倒置显微镜及相机、扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜、共聚焦显微镜（二）实验方法 1．对有无悬浮细胞的条件下，用含有rhGM—CSF 800^?／ml、IL-4 500^?／和TNF-α250^?／ml的无血清培养基，诱导培养DC细胞，并在光镜下每天记录形态学变化； 2．胞仪分析DC细胞Lin—HLA-DR+细胞群的CD83、CD1a、CD86、CD80、CD11c、CD123的表达情况； 3．胞仪分析DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69变化，进而分析CD4+T细胞的CD4／CD3、CD4／CD25、CD45RO／CD45RA、CD4／CD28亚群以及CD8+T细胞的CD8／CD3、CD8／CD25、CD45RO／CD45RA、CD8／CD28亚群比例的变化情况;4.当DC细胞被抑制时，用RNAase抑制RNA、核酸染料PI标记细胞DNA，在流式细胞仪上分析在T细胞的周期变化;5.流式细胞仪分析T细胞分泌的细胞因子IFN一Y和IL一4的情况，间接获悉T细胞的定向分化;6.AnnexinV一FITC/PI双染法流式细胞分析试剂盒分析DC细胞递呈抗原后的凋亡情况;扫描电镜和透射电镜分析DC细胞表面和细胞内的超微结构，寻找其结构特征;7.利用AFM在纳米水平上进一步分析DC细胞的超微结构以及其与T细胞作用方式;8.免疫电镜观察CD86的表达位置;9.利用共聚焦显微镜分析DC细胞的特征性CD分子的表达情况，观察DC细胞与T细胞的作用过程、DC细胞吞噬抗原的过程、DC细胞内游离CaZ十的变化过程以及DC细胞凋亡的过程三、结果:1.光镜下见贴壁细胞在培养过程中（7天）逐渐长出长短不一树突状突起，细胞形态不一;电镜观察到DC表面呈多层“面纱”覆盖，有大量皱褶，“面纱”边缘有长短不一的不规则的树突状突起，每个突起有多级分枝;AFM见DC细胞的“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成的，各个DC细胞之间的突起相互连接，构成集落;2.DC细胞表型在Lin--和HLA一DR+细胞群中，各CD分子表达的百分比为:CD123/54.5、CDlle/88.99、CD4O/56.65、CDla/69.36、CD86/92.57、CDSO/70.79、CD83/85.91;3.DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69明显升高，CD4+CD69+/19.05%;CDS+CD69+/21，93%;4.CD4+和CDS+的两组细胞的CD3+、CD25+、CD45RO+/CD45RA+的百分率均增高，CD28+的百分率和CD45RO一/CD45RA+的百分率均下降;CD4+/CD28-和CDS+/CD28一的百分率亦升高;5.DC细胞递呈抗原后，T细胞的S期细胞的比率从0.66%增加为7.21%;而DC的死亡率和凋亡率，分别由0.05%和0.00%升为6.95%和4.65%; 36.DC细胞含有丰富的线立体、微管和微丝系统;凋亡的DC细胞，其细胞核染色质固缩，内吞体严重扩张，细胞膜空泡化;7.CD86分子主要聚集于胞体特定的区域内，突起部位表达较少，CD83和CDla表达在细胞膜上，而CDllc则表达在细胞体部位;8.羊抗小鼠IgG一F工TC分子随时间不同逐渐由细胞膜分布到整个DC细胞;9.DC细胞递呈抗原后，CaZ+浓度升高，随即细胞破裂。四.结论:1.该方法可以诱导出的成熟DC细胞，形态典型，而且少量悬浮细胞不影响DC细胞的分化和成熟;“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成，扩大了DC细胞的膜结构，是有效捕获抗原的结构基础;2.DC细胞多个亚群可共存生长，绝大多数为MDC，而且成熟度高并表达丰富的双信号分子;3.DC细胞具有吞噬功能，可以诱导T细胞活化、增殖，具有递呈抗原功育旨;4.DC细胞递呈抗原后，在T细胞的作用下，DC细胞伴随细胞内CaZ十浓度的升高走向凋亡和死亡，且凋亡为非同步性。

全文目录

缩略语表  6-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-16
第一部分 DC的培养及其功能学研究  16-54
  一. 样本  16
  二. 实验试剂及耗材  16
  三. 主要仪器  16-17
  四. 试剂配制  17-18
  第一章 DC细胞培养  18-23
    一. 方法  18
      1 DC细胞的培养  18
      2 光镜下观察培养过程中DC细胞的形态学变化并拍照  18
    二. 结果  18-21
    三. 结论  21-23
  第二章 DC细胞表型分析  23-27
    一. 方法  23
      1 DC细胞的培养单细胞悬液  23
      2 DC细胞免疫荧光标记  23
      3 FACS分析DC细胞免疫表型  23
    二. 结果  23-26
    三. 结论  26
    四. 讨论  26-27
  第三章 DC细胞诱导T淋巴细胞活化及亚群的变化情况  27-36
    一. 方法:实验分2部分进行  27-28
      1 第1部分:DC细胞诱导T细胞活化实验  27
      2 第2部分:DC细胞诱导T淋巴细胞各亚群分化  27-28
    二. 结果  28-32
    三. 结论  32-33
    四. 讨论  33-36
  第四章 DC细胞诱导T淋巴细胞增殖  36-41
    一. 方法  36
      1 成熟DC细胞培养以及获得  36
      2 分离同一供体外周血淋巴细胞  36
      3 抑制DC细胞增殖并诱导T淋巴细胞活化  36
      4 灭活RNA并检测PI值  36
    二. 结果  36-38
    三. 结论  38
    四. 讨论  38-41
  第五章 DC细胞诱导T淋巴细胞定向分化的研究  41-51
    一. 方法  41-42
      1 培养成熟DC细胞  41
      2 多克隆T淋巴细胞的制备及其激活  41
      3 固定并破膜  41
      4 免疫标记  41
      5 三色法FCM检测和分析  41-42
    二. 结果  42-46
    三. 结论  46
    四. 讨论  46-51
  第六章 DC细胞递呈抗原后的凋亡情况  51-54
    一. 方法  51
      1 培养DC细胞  51
      2 培养并分离外周血淋巴细胞方法同前  51
      3 DC细胞递呈抗原，诱导T淋巴细胞活化  51
      4 Annexin V-FITC vs PI标记DC细胞细胞  51
      5 FCM检测  51
    二. 结果  51-53
    三. 结论  53
    四. 讨论  53-54
第二部分 DC细胞递呈抗原的形态学基础  54-78
  第一章 DC细胞的CD86表达位点与超微结构  54-58
    一. 方法  54-55
      1 扫描电镜观察DC细胞及其与T细胞作用  54
      2 透射电镜观察DC细胞的树突状结构及凋亡状态的DC细胞超微结构  54
      3 织化学法观察DC细胞黏附分子CD86的表达位置  54-55
    二. 结果  55-57
    三. 结论  57-58
  第二章原子力显微镜分析DC细胞结构  58-64
    一. 方法  58
      1 AFM对DC细胞超微结构的纳米级检测  58
      2 AFM对DC细胞与淋巴细胞相互作用的纳米级检测  58
    二. 结果  58-62
    三. 结论  62
    四. 讨论  62-64
  第三章 DC细胞CD分子分布及与T细胞相互作用的动态分析  64-78
    一. 方法  64-68
      1 共聚焦显微镜观察DC细胞表面CD分子的表达位点  64
      2 镜观察DC细胞与CD4+T淋巴细胞的相互作用(静态)  64
      3 共聚焦显微镜观察DC的吞噬功能  64-65
      4 DC细胞在抗原提呈过程中细胞内Ca~+浓度以及其形态学的变化测定  65-68
    二. 结果  68-74
    三. 结论  74
    四. 讨论  74-78
研究结论  78-80
参考文献  80-84
致谢  84-85
综述  85-91

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