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EAN脑保护与脑损伤修复三细胞模型系统中的内皮细胞及神经元形态特征

作　者: 郑铁铮
导　师: 孙长凯
学　校: 大连医科大学
专　业: 神经生物学
关键词: 新生大鼠大脑毛细血管内皮细胞神经元共聚焦显微镜 MAP-2 Glut-1
分类号: R651.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：随着对中枢神经系统中神经元及毛细血管内皮细胞的研究不断深入,我们迫切地期望获得一种既可以维持这两种细胞在体内中的正常形态及功能,又可以对其生长环境进行人为调节控制的细胞生长载体。在体内实验中,实验动物体内环境虽然能完整地保留这两种细胞的各种特征,但是过于复杂的体内环境及体内大量不可控因素将导致神经元或内皮细胞的实验结果产生偏差。同时动物之间的个体差异以及高昂的实验动物费用,也是体内实验不可回避的缺点。单独体外培养神经元或大脑毛细血管内皮细胞,虽避免了体内环境中大量不可控因素,但过于简单的培养环境,往往导致使大脑毛细血管内皮细胞丧失其体内的部分生物学特性,同时神经元的存活时间过短,导致实验窗口时间变短。目前有些实验室将内皮细胞或神经元与星形胶质细胞进行共培养,虽然使神经元的存活时间有所延长并使内皮细胞一定程度上保持了其体内特点,但所用细胞或细胞系来自不同动物个体的原代培养细胞,其不足也是显而易见。因此,本文运用Transwell技术构建Sprague-Dawley (SD)大鼠大脑毛细血管内皮细胞(endothelial cell,E)、星形胶质细胞(astrocyte,A)及神经元(neuron, N)三细胞共培养系统。观察共培养系统中大脑毛细血管内皮细胞、神经元的形态特征并与单独培养的大脑毛细血管内皮细胞、神经元的形态进行比较。方法：将SD大鼠的大脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、神经元进行原代培养,细胞纯化后,利用Transwell将三种细胞按一定时间和空间顺序建立EAN三细胞共培养模型系统。系统稳定后,用小鼠抗大鼠微管相关蛋白2 (Microtubule-Associated Protein 2,MAP-2)单克隆抗体,兔抗大鼠葡萄糖装运体1(Glucose Transport 1,Glut-1)多克隆抗体及相对应的荧光二抗分别对神经元和大脑毛细血管内皮细胞进行免疫荧光染色,并用荧光显微镜及激光共聚焦显微镜分别拍摄单独培养和EAN系统中神经元和大脑毛细血管内皮细胞的免疫荧光图像,利用图像分析软件Image-pro Plus6.0,对神经元和大脑毛细血管内皮细胞的形态变化进行量化分析比较。由于神经元状态是否良好的一个显著特点是其树突的生长状态,所以本文以神经元的树突长度为指标,来评价神经元的状态。而内皮细胞在体内为长梭形,本文根据内皮细胞在体内的特殊形态,将内皮细胞长轴短轴比,作为一个测量指标。结果：(1)EAN模型中神经元树突中MAP-2阳性区长度为204.6±25.3μm,单独培养的神经元树突中MAP-2阳性区长度为125.8±25.8μm。EAN模型中神经元树突中MAP-2阳性区长度明显大于单独培养的神经元树突中MAP-2阳性区长度,具有统计学差异(n=10,p<0.01)。(2)EAN模型中大脑毛细血管内皮细胞内Glut-1阳性区的长轴短轴比值为9.22±1.1,单独培养大脑毛细血管内皮细胞内Glut-1阳性区的长轴短轴比值为2.3±0.6。EAN模型中大脑毛细血管内皮细胞内Glut-1阳性区的长轴短轴比值明显大于单独培养大脑毛细血管内皮细胞内Glut-1阳性区的长轴与短轴之比值,具有统计学差异(n=5,P<0.01)结论：本文所构建的原代大鼠大脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元EAN三细胞共培养的模型体系中,神经元和大脑毛细血管内皮细胞与各自单独培养条件相比较,其形态学特征存在明显差异。EAN系统中大脑毛细血管内皮细胞呈长梭形,而单独培养的为不规则多边形。EAN系统中,培养20天后的神经元突起依旧丰富,各神经元之间的树突相互交错,形成网络。单独培养20天后的神经元树突的数量明显减少,而且其长度明显短于培养在EAN系统中神经元的树突长度。

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摘要 5-7英文摘要 7-9前言 9-10材料与方法 10-17结果 17-24讨论 24-26结论 26-27参考文献 27-29综述 29-38 参考文献 34-38附录 38-39致谢 39-40

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