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中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定、致病及免疫机制研究

作　者: 徐海圣
导　师: 徐步进
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 中华绒螯蟹病原副溶血弧菌气单胞菌致病因子胞外蛋白酶气溶素凝集素免疫机制
分类号: S945
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

对患弧菌病的中华绒螯蟹进行了细菌性病原的分离和鉴定，从病蟹体内分离到三株病原菌，其生理生化特性、菌株形态及菌落形态均一致，经鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）。人工注射感染健康蟹，2d内均发生死亡，死亡率100％，并且症状同自然发病症状相似，证实副溶血弧菌为中华绒螯蟹弧菌病的病原菌。药物敏感试验结果表明，此病原菌对链霉素、利福平、卡那霉素、复方新诺明、环丙沙星、氟哌酸、四环素、氟嗪酸、复达欣、菌必治、萘啶酸等药物高度敏感。分离菌株培养物经离心、（NH₄）₂SO₄沉淀、透析、浓缩及过滤除菌获得的ECP蛋白具有明胶酶、几丁质酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂酶、磷脂酶等多种酶活性及溶血活性，但不具有脲酶活性，对中华绒螯蟹具有明显的致病作用。利用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法，从其胞外产物中分离纯化出了2种胞外蛋白酶，用SDS-PAGE电泳测得两种蛋白酶的分子量分别为39.6kD和20kD。39.6kD蛋白酶活性在50℃～60℃范围内热稳定性最好，最适pH为9，而20kD蛋白酶的最适温度为50℃，最适pH为8。EDTA可抑制39.6kD蛋白酶的酶活性，金属离子Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺对39.6kD蛋白酶有一定的抑制作用，而Ca²⁺对酶有一定程度的激活作用，因此39.6kD蛋白酶是一种金属蛋白酶；PMSF可抑制20kD蛋白酶的酶活性，说明该酶属于丝氨酸蛋白酶类。这两种纯化的蛋白酶对体外培养Vero细胞及中华绒螯蟹肝胰腺细胞均具毒性作用。以实验中分离到的蟹源致病性的副溶血弧菌基因组DNA为模板，利用设计的特异引物，扩增出一条长约2kb的PCR产物，证明在其基因组DNA中含有相关胞外蛋白酶基因。对患气单胞菌病（含腹水病）的中华绒螯蟹进行了细菌性病原的分离和鉴定，从病蟹体内分离到三株病原菌，均为革兰氏阴性杆菌，单极生鞭毛，运动，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸产气等，经鉴定这三株病原菌均属气单胞菌；再经其它生物学特性测定，两株与易损气单胞菌的形态特征、生理生化特性基本相同，故将这两株病原菌鉴定为易损气单胞菌（Aeromonas trota）；另外一株与嗜水气单胞菌的形态特征、生理生化特性基本相同，故将此株病原菌鉴定为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）。蟹源致病性的易损气单胞菌和嗜水气单胞菌均可产生外膜蛋白、胞外蛋白酶、溶血素等致病因子。根据气单胞菌已发表的气溶素基因序列设计引物，采用PCR技术，从蟹源致病性易损气单胞基因组中克隆出长为622bp的基因片断，内切酶BamHI对扩增产物进行酶切，产生长约570bp和50bp两条片断。研究还利用设计的特异引物，采用PCR技术，对蟹源致病性易损气单胞菌进行了快速分子鉴定的研究。中华绒鳌蟹“抖抖病”是一种危害严重、流行面广的蟹病，为防治该病我们对病蟹进行了病原初步研究。研究发现，病蟹体内存在着大量的病原菌，能在3天内使健康蟹全部死亡，死亡率为100%，该细菌属革兰氏阴性杆菌，单极生鞭毛，运动，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸不产气，氧化酶、七叶普、过氧化氢酶阳性，能还原稍酸盐等，其形态特征及生理生化反应同豚鼠气单胞菌基本相同，故鉴定为豚鼠气单胞菌。我们用病蟹无菌组织滤液感染健康蟹，出现“抖抖病”的典型症状，并在患病中华绒蟹蟹的组织细胞超微结构中发现有病毒拉子，而且在病蟹无菌组织滤液中也发现了大量的球状病毒粒子，大小为60nm左右。因此，中华绒鳌蟹的暴发性死亡是由球状病毒和豚鼠气单胞菌等致病细菌共同感染而引起的运用硫酸按盐析、GlcNAc一sePharose 6B亲合层析等方法从中华绒鳌蟹的血清中分离出一种天然的凝集素，经SDS一PAGE测得其分子量约为82kD，由单一亚基组成，由等电聚焦凝胶电泳测得其等电点（PI）为5.4。糖凝集抑制试验中检测到葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、果糖、蔗糖等6种单糖对中华绒登蟹血清凝集素均没有抑制作用，但N一乙酞氛基糖GlcNAc、GalNAc、ManNAc等能抑制其凝集活性。热变性实验结果表明，当温度在10⁵0℃范围内时，凝集素仍保持强的凝集活性，但当温度升至60℃后，凝集活性迅速下降，至80℃失去凝集活性，在pH4.O一8.0的各缓冲液中保持较强的凝集活性，而在此pH值范围之外，凝集活性均有不同程度的下降。中华绒鳌蟹血清凝集素除可使外源红血细胞发生凝集外，还具有凝集细菌或杭菌作用。为了防治中华绒鳌蟹的传染性疾病，使用各种杭菌剂仍被作为目前的主要对策，但是由于耐药性病原菌的形成以及环境污染问题等方面的考虑，正确使用疫苗或免疫增强剂来提高中华绒蟹蟹自身的杭病能力，是以后预防蟹病发生的途径。尽管甲壳动物的血淋巴液内不存在免疫球蛋白，但是具有非特异性免疫的性质，适当的诱导可提高血细胞的吞噬能力及多种体液免疫因子的数量和活性。研究发现，肌肉注射嗜水气单胞菌疫苗后一定时间内，中华绒鳌蟹血清溶菌酶、超氧化物酶歧化酶（S OD）、酚氧化酶（PO）活力均有所升高，免疫保护率为74.7%，证明肌肉注射嗜水气单胞菌疫苗的确能够增强中华绒餐蟹的免疫杭病能力。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-12
第一部分中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定及致病机理  12-67
  第一章中华绒螯蟹弧菌病病原菌的分离鉴定及其胞外蛋白酶(ECPase)的研究  12-37
    1 材料与方法  12-17
    2 结果  17-33
    3 讨论  33-37
  第二章中华绒螯蟹气单胞菌病原的分离鉴定、药物敏感性及其致病因子的研究  37-50
    1 材料与方法  37-39
    2 结果  39-48
    3 讨论  48-50
  第三章蟹源致病性易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其PCR快速检测的研究  50-58
    1 材料与方法  50-52
    2 结果  52-56
    3 讨论  56-58
  第四章中华绒螯蟹“抖抖病”病原的研究  58-67
    1 材料与方法  58-59
    2 结果  59-65
    3 讨论  65-67
第二部分中华绒螯蟹免疫机制的研究  67-93
  第五章中华绒螯蟹血淋巴凝集素及疫苗对非特异性免疫功能诱导的研究  67-93
    一、甲壳动物的免疫机制研究进展(综述)  67-75
      1 细胞免疫机理  67-70
        1.1 血细胞的分类  67-69
        1.2 血细胞的功能  69-70
      2 体液免疫机理  70-74
        2.1 酚氧化酶原激活系统  70-71
        2.2 溶血素  71
        2.3 凝集素  71-72
        2.4 溶菌酶  72
        2.5 蛋白酶抑制剂  72-73
        2.6 细胞活性氧离子(ROIs)  73
        2.7 抗菌肽  73-74
      3 研究展望  74-75
    二、中华绒螯蟹血淋巴凝集素的分离纯与部分性质研究  75-85
      1 材料与方法  75-78
      2 结果  78-82
      3 讨论  82-85
    三、疫苗对中华绒螯蟹非特异性免疫功能的诱导研究  85-93
      1 材料与方法  86-87
      2 结果  87-90
      3 讨论  90-93
第三部分总结  93-95
  一、本研究取得的进展和创新点  93-94
  二、研究展望  94-95
参考文献(Ⅰ)  95-106
参考文献(Ⅱ)  106-118
附件(攻博期间发表的论文)  118-119
致谢  119

中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定、致病及免疫机制研究

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