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新基因CRLP功能的初步研究

作　者: 汪朝晖
导　师: 顾健人
学　校: 复旦大学
专　业: 病原生物学
关键词: 生长曲线克隆形成转染启动子放射杂交定位凋亡化疗药物 TPR基序 DNA修复复合体转录抑制复合体神经营养因子受体分化
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

CRLP(Crn-like Protein)是通过我室建立的高通量cDNA转染技术从人类胎盘cDNA文库中筛选出的具有完整编码序列的新基因。CRLP的cDNA全长约2.7Kb，可编码855个氨基酸的蛋白质，预期分子量为100KDa。该基因在Genebank登录号为AF258567。在Genebank的数据库中应用相应软件对CRLP的核酸序列进行了生物信息学分析。BLASTn分析结果表明，CRLP基因具有19个外显子，18个内含子，定位于人类染色体19p13.3。放射杂交（RH）定位的数据进一步证实了这个结论。氨基酸序列分析表明，在大鼠、果蝇、线虫以及酵母等生物中均有同源蛋白存在。CRLP蛋白有15个TPR基序，TPR基序由34个氨基酸组成，在当中只有8个位置的氨基酸残基是高度保守的，而它的二级结构却是极为一致的[1,2]。目前的研究发现TPR基序可介导不同蛋白分子之间的相互作用，并且还与细胞周期、转录和蛋白质运输等重要的功能有关，这提示着CRLP在细胞活性中有重要的作用[3-5]。多组织Northern杂交的结果表明，在所检测的八种组织：心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺中均检测到了CRLP基因的表达。应用RT-PCR的方法检测了肝癌细胞株、肝母细胞瘤、转化肝细胞株、乳腺癌细胞株、卵巢癌细胞株、乳腺癌细胞株、子宫颈癌细胞株、骨肉瘤细胞株，在它们当中均检测到了CRLP基因的转录。由于CRLP在所检测的组织和细胞中均有表达和在进化中结构高度保守[6]，这提示它很有可能是一个持家基因。对CRLP分子的启动子进行了初步研究。将CRLP的翻译起始点上游约1Kb的片段插入到pGL3载体的无启动子的报告基因Firefly Luciferase 的前面，双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性的数据表明，这个片段具有对照SV40启动子活性的1/33。本实验构建了可表达CRLP-EGFP融合蛋白的质粒，将CRLP-EGFP转导进入肝癌细胞株BEL7402，融合蛋白定位于细胞核，表明CRLP可能具有在核内的功能。<WP=5>为了研究CRLP在细胞中的生理功能，将CRLP的编码序列插入到表达质粒pcDNA3.1中。细胞生长曲线、克隆形成实验证实CRLP的过量表达对细胞的生长有抑制作用。由于TPR基序与转录抑制复合体相关[7,8]，因而CRLP可通过协助该复合体的形成抑制细胞的生长。已有文献报道，CRLP可能与DNA修复复合体中的XPA结合[9]。用紫外照射损伤DNA后，进一步研究了细胞中CRLP和DNA修复过程的关系。当内源性的CRLP被反义抑制后，凋亡的细胞明显增加。当细胞用化疗药物阿霉素或顺铂处理以后，细胞生长曲线显示CRLP的表达有利于细胞抗药性的提高，而CRLP被反义下调后则降低了细胞的抗药性。这提示由XPA介导的CRLP参与DNA修复复合体对DNA修复活性是必需的。CRLP分子中为数众多的TPR基序提示其功能可能是多方面的，它的15个TPR基序可分为3个TPR串联簇（D1，D2，D3）。为了确定不同区段和不同TPR基序数目以及它在空间位置上关系的生物意义，构建了缺失N端、中部和C端的5个截断突变体（mut1、mut2、mut3、mut4、mut5）。首先建立了稳定转染的BEL7402细胞株。全长CRLP转染的细胞对阿霉素或顺铂有抗药性，反义CRLP转染的细胞对两种药物均敏感。在5个突变体转染的细胞株中，完全缺失TPR的mut1转染的细胞的抗药性没有变化；只有C端的TPR串联簇D3的mut2转染的细胞的抗药性也没有变化；但对于在TPR的数目上不同的具有N端的TPR串联簇D1的mut3和mut4，转染细胞株的抗药性显著提高；没有观察到只有中部TPR串联簇D2的mut5的转染细胞的抗药性变化。这些结果有力地表明N端的TPR串联簇对DNA修复活性相关的抗药性是很重要的。我们也检测了5个突变体转染细胞的生长，细胞生长曲线实验显示mut2和mut5的过量表达抑制了细胞生长，而mut1、mut3、mut4没有抑制作用。这表明中部和C端的TPR串联簇可能有形成转录抑制复合体抑制细胞生长的作用。复旦大学遗传系用酵母双杂交系统筛选人胎盘cDNA文库发现CRLP与P75NTR（Neurotrophin receptor，神经营养因子受体）有相互作用，P75NTR能够介导神经细胞分化[10]。本研究应用大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的转染实验发现，全长的CRLP的过量表达可诱导PC12细胞分化，具有D3的mut2和D2的mut5也有此功能，mut1、mut3、mut4无此功能。这个结果提示P75NTR与CRLP的D2(中部的TPR串联簇)、D3(C端的TPR串联簇)的作用是激活P75NTR,因而诱导神经元分化。总之CRLP基因功能的初步研究结果显示CRLP可能是一个复杂的、多功能的生物分子，可能对大部分细胞的转录抑制复合体的形成，DNA修复以及神经元分化很重要。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
第一部分 CRLP基因的生物信息学  9-37
  前言  9-10
  材料与方法  10-19
  结果  19-33
  讨论  33-37
第二部分 CRLP基因生物功能的初步研究  37-74
  前言  37-38
  材料与方法  38-49
  结果  49-67
  讨论  67-74
参考文献  74-79
综述  79-85
致谢  85-86

新基因CRLP功能的初步研究

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