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PC12-GFRα1基因工程细胞株的构建及GDNF下游信号传导通路研究

作　者: 柴延丰
导　师: 崔瑞耀
学　校: 青岛大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF） 胶质细胞源性神经营养因子受体(1（GFR(1） 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12） 受体酪氨酸激酶 (Ret) 糖基磷脂酰肌醇(GPI) 细胞外调节激酶（ERK）-丝裂原-激活蛋白激酶通路（MAP） 磷酸肌醇激酶（PI 3-kinase）通路
分类号: R361.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）于1993年由Lin LF等发现，它的成熟蛋白质由134个氨基酸残基组成，属于转化因子(-超家族成员，是目前发现的特异性最强的多巴胺能神经元营 养因子，因其对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元及交感神经元等多种神经元有较强的营养作用而受到关注。 大量的研究表明，GDNF极有希望用于帕金森氏病和脊髓侧索硬化症等神经退行性疾病的治疗及神经损伤的修复。GDNF的信号传导同时需要受体酪氨酸激酶(Ret) 和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚合的受体GFR(。GDNF和GFR(结合并结合Ret，引起Ret磷酸化，磷酸化后的Ret能激活细胞内的多条信号通路，其中以细胞外调节激酶（ERK）-丝裂原-激活蛋白激酶通路（MAP）和磷酸肌醇激酶（PI 3-kinase）通路尤为重要。大 鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞系是研究神经营养因子功能和作用机制的常用细胞系，PC12细胞可以表达低水平的Ret， 但不表达GFR(。据此，我们将GDNF受体GFR(1转染到PC12细胞，使其同时表达GFR(1和Ret，从而构建一种方便、可 靠的用于GDNF测活的细胞株，并为进一步研究GDNF的下游信号传导及神经营养作用机制带来方便，通过使用MAPKK抑制剂PD98059和PI-3激酶抑制剂LY294002来研究MAPK通路和PI-3激酶通路在GDNF诱导PC12细胞分化及促进其在无血清培养基<WP=5>中存活的作用。本研究主要结果为将pcDNA3-GFR(1表达质粒转染到PC12细胞中，经G418筛选后获得单克隆细胞，RT-PCR 结果检测到GFR(1的表达构建了基因工程细胞株PC12-GFR(1。以PC12-GFR(1细胞突起生长为分化的指标，GDNF作用7天后，可以明显引起PC12细胞向神经元分化，0.01ng/ml GDNF即可引起细胞的突起生长, 0.1ng/ml GDNF诱导细胞分化的作用和对照组相比即有显著性差异。GDNF对无血清培养的PC12-GFR(1细胞的促存活作用，在无血清的培养基中，PC12细胞很快出现凋亡，而加入GDNF后则明显促进其存活，0.01ng/ml的GDNF对PC12-GFR(1细胞的促存活作用和对照组相比即有显著性差异（P<0.05）,在10ng/ml浓度时作用更显著，因此在研究抑制剂作用时采用该浓度。在已经构建了可以稳定表达GFR(1的细胞株PC12-GFR(1的基础上，研究细胞外调节激酶（ERK）-丝裂原-激活蛋白激酶通路（MAP）和磷酸肌醇激酶（PI3-kinase）通路在GDNF引起PC12细胞分化及促进PC12细胞在无血清培养基中存活的作用，将不同浓度的PD98059 (MAPKK特异性抑制剂) 加入PC12-GFR(1细胞中，培养15min后加入GDNF, 观察PD98059对GDNF促PC12-GFR(1细胞存活及分化作用的影响，发现PD98059能够显著影响GDNF诱导细胞突起生长，而对GDNF促细胞存活作用则没有影响。10(M PD98059即完全阻断GDNF的诱导PC12细胞分化。提示MAPK通路是GDNF诱导PC12-GFR(1细胞分化所必不可少的信号传导途径，而在GDNF促进细胞存活中则不起主要作用。为进一步了解PI-3激酶通路在GDNF促进PC12细胞存活及分化中的作用，观察了PI-3激酶的特异性抑制剂LY294004对GDNF促细胞存活及分化的影响。结果发现，加入LY294002后，GDNF对无血清培养条件下的PC12-GFR(1细胞的促存活作用受到抑制，并且呈剂量依赖性，随着LY294002浓度增加，细胞存活率下降，在1(M时即有统计学差异，IC50约为2(M。提示GDNF促进PC12细胞存活是通过PI-3激酶依赖性机制起作用。本研究成功地构建了基因工程细胞株PC12-GFR(1，该基<WP=6>因工程细胞和多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元及交感神经元一样可以同时表达Ret和GFR(1，因而可以反映GDNF在生理状态下对神经元的神经营养作用，不仅使GDNF的活性测定方法简便化，而且为研究GDNF的神经营养作用的下游信号转导通路提供了良好的细胞模型。国内外尚未见报道。首次在PC12细胞发现PD98059能够显著影响GDNF诱导细胞分化，而对GDNF促细胞在无血清培养基中存活作用则没有影响。10(M PD98059即完全阻断GDNF的诱导PC12细胞分化。提示MAPK通路是GDNF诱导PC12-GFR(1细胞分化所必不可少的信号传导途径，而在GDNF促进细胞存活中则不起主要作用。首次在PC12细胞发现PI-3激酶的特异性抑制剂LY294004可以抑制GDNF对无血清培养条件下的PC12-GFR(1细胞的促存活作用，并且该抑制作用呈剂量依赖性，随着LY294002浓度增加，细胞存活率下降。提示GDNF促进PC12细胞存活是通过PI-3激酶依赖性机制起作用。

全文目录


英文缩略词表  3-4
中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-14
材料、方法与结果  14-27
讨论  27-30
小结  30-31
参考文献  31-34
致谢  34-35
综述与参考文献  35-52
附录  52

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理解剖学与组织学 > 细胞病理学
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