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绿色荧光蛋白融合基因在小鼠早期胚胎表达的研究

作　者: 安志兴
导　师: 张涌
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 绿色荧光蛋白(GFP) 转基因 原核注射 早期表达 胚胎 小鼠
分类号: S814
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
下　载: 515次
引　用: 3次
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内容摘要


转基因小鼠的制作为研究基因表达调控、基因整合机制及癌变病理提供了理想的研究模型，为乳腺反应器的研究奠定基础。本试验首先建立稳定的昆明白小鼠原核期胚胎体外培养系统，应用原核注射法将绿色荧光蛋白(GFP)融合基因导入小鼠原核受精卵的雄原核内，重点对早期转基因胚胎发育过程进行观察，监测GFP的表达情况，以期实现在胚胎植入前完成对外源基因整合表达检测，结果表明： 1．比较小鼠原核胚在几种培养液中体外发育状况，分别为M16、CZB和KSOM，其中以KSOM的培养效果最好，囊胚形成率显著高于M16和CZB(85％比14.7％，10.81％，P＜0.01)。在CZB和KSOM添加10％的胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白(BSA)，培养结果显示添加FBS组明显优于BSA组(P＜0.05)，FBS对后期胚胎的发育更为有利。在采用输卵管上皮共培养时，与无共培养系统的结果相比，发育趋向同步，质量较好，胚胎发育率提高，但差异不显著。本试验表明采用添加10％FBS的KSOM培养液，与输卵管上皮共培养，能够有效的支持昆明白小鼠原核期胚胎体外发育。 2．采用程序化冷冻方法，对不同植冰温度下几种冷冻液的结晶变化进行了分析，并比较其对小鼠胚胎的冷冻效果。—5℃植冰时，3种冷冻液PEF、PGF和PEGF只有部分结晶：当植冰温度为—5.5℃时，PEF和PEGF完全结晶时间为10min，PGF在15min未完全结晶；—6℃植冰时，3种冷冻液完全结晶时分别为8，10和10min；—6.5℃植冰后完全结晶时间分别为5，8和5 min。将小鼠胚胎载入上述三种冷冻液，—5.5℃植冰冷冻解冻后囊胚孵化发育率分别为81.7％，68.5％和87.5％，—6℃植冰时发育率分别为80％0，76.5％和90.9％，—6.5℃植冰后的发育率分别为10％，13.3％和38.4％。结果表明，在—5.5或—6℃时植冰、PEGF作为冷冻保护液冷冻保存小鼠胚胎效果较好。 3．在构建GFP融合基因过程中，采用pEGFP-C1型真核表达载体，具有强的启动子CMV，能够实现在适当转录条件就可以调控下目的基因的表达。在设计融合基因时，在bcl-2的转录起始位点前经PCR插入碱基T，保证读码框正确。将bcl-2基因的cDNA片段克隆到载体的MCS，用双酶切得到线性化的片段，可以用于转基因的研究。 4．将表达载体经酶切后，得到大小约为2.3kb的片段，纯化回收并经乙醇沉淀，溶于转基因用TE溶液中，浓度为1～3μg／mL，分装后备用。小鼠原核胚胎分别于AM10：00和PM4：00获得并进行原核注射，在PM4：00时，大部分胚胎可以观察到原核，原核比较清楚，发育结果好于AM10：00时获取的胚胎。另外在上午将小鼠处死后得到的胚胎，其发育率低于另一组，绿色荧光蛋白融合基因在小鼠早期胚胎表达的研究尽管差异不显著。在试验中一般于PM4:00收集胚胎进行显微操作。5.对桑甚期胚胎进行紫外照射，不同照射时间对胚胎的发育影响显著。照射105、加s和405 时，与对照组相比，囊胚发育率分别为85.14%、78.33%、56.67%和88.46%，照射205时 对胚胎影响显著，在照射405时胚胎的发育率极显著降低(P<0.01)。UV对胚胎的照射时间 不超过205为宜。6.原核注射后的胚胎在体外培养，观察在CMV启动下GFP的表达情况。UV下检查，个别2- 细胞就开始表现出绿色荧光，但发现早期表达的胚胎多数不能发育下去。随着培养时间的延 长，表达GFP的胚胎数量增加，以8~16细胞时达到最多。在形成的囊胚中，表达绿色荧光 的占26.5%，与经过原核注射的胚胎相比，占10.6%。说明可以利用原核注射法进行转基因 的研究。7.将发育到桑囊期的胚胎分割，取部分样品用于特异性PCR扩增，片段大小为6。。bp，结合荧 光观察结果，实验表明表达绿色荧光蛋白的胚胎，其PCR扩增反应阳性率为100%，同时说 明外源基因在胚胎发育早期可以表达，绿色荧光蛋白可以作为报告基因来实现对早期基因整 合及表达的监测。8.在胚胎移植中，整胚的妊娠率显著高于半胚(22.09%比12.5%)，可能是在分割中对胚胎造成 损伤引起的。表达荧光的形态正常胚胎在移植后没有得到个体，但在移植后8一10d处死小鼠， 分离子宫后发现有附着点存在，可能是外源基因，特别是bel一2的表达影响胚胎的正常发育生 长。

全文目录


前言  10-12
摘要  12-14
文献综述  14-68
  第一章 哺乳动物转基因技术研究进展  14-50
    1 哺乳动物转基因方法的研究  14-23
      1.1 原核期胚胎的显微注射技术  14-16
        1.1.1 显微注射技术原理及发展  14-16
        1.1.2 显微注射技术的优点及缺点  16
      1.2 逆转录病毒载体侵染技术  16-17
        1.2.1 逆转录病毒载体侵染技术原理及发展  16-17
        1.2.2 逆转录病毒载体侵染技术的优点和不足  17
      1.3 精子载体技术  17-18
        1.3.1 精子载体技术的原理与发展  17-18
        1.3.2 精子载体技术的优点及不足  18
      1.4 体细胞核移植技术  18-20
        1.4.1 体细胞核移植技术的原理及发展  19
        1.4.2 体细胞核移植技术的优点及不足  19-20
      1.5 ES细胞介导技术  20-21
        1.5.1 ES细胞介导技术的原理及发展  20-21
        1.5.2 ES细胞介导技术的优点及不足  21
      1.6 PGCs技术  21
      1.7 胞内单精注射技术  21-22
      1.8 受体介导的基因转移  22-23
    2 提高转基因的策略  23-33
      2.1 外源基因的整合机制  23-25
        2.1.1 转基因整合机制概述  23-25
        2.1.2 外源基因整合的位置效应  25
      2.2 转基因表达载体的构建  25-29
        2.2.1 目的基因选择  26
        2.2.2 启动子的选择  26
        2.2.3 提高外源基因表达的其他策略  26-29
      2.3 应用于转基因的基因打靶技术  29-33
        2.3.1 基因打靶策略  29-32
        2.3.2 打靶载体的筛选  32-33
    3 转基因技术的应用及展望  33-38
      3.1 乳腺生物反应器  33-35
        3.1.1 乳腺生物反应器的定义  33
        3.1.2 乳腺生物反应器的研究发展  33-35
        3.1.3 乳腺生物反应器的优点  35
      3.2 特定基因功能的研究  35-36
      3.3 在医学领域中的应用  36-37
        3.3.1 制造人类疾病的转基因动物模型  36
        3.3.2 组织器官移植  36-37
      3.4 在畜牧业中的应用  37-38
        3.4.1 促进动物生长，提高畜产品品质  37
        3.4.2 动物抗病育种  37-38
    4 转基因技术存在的问题及建议  38-40
      4.1 转基因技术存在的问题  38-39
        4.1.1 成本高、整合效率总体比较低  38
        4.1.2 转基因表达水平低  38
        4.1.3 难以控制转基因在宿主基因组中的行为  38-39
        4.1.4 目的基因与动物生产性状的多基因矛盾突出  39
        4.1.5 转基因动物及其产品的安全性问题  39
      4.2 建议  39-40
    参考文献  40-50
  第二章 绿色荧光蛋白(GFP)-理想的转基因报告系统  50-68
    1 转基因报告系统的研究进展  50-53
      1.1 氯霉素转乙酰酶(phenicolacetyl transferase，CAT)报告基因  50-51
      1.2 β-半乳糖苷酶报告基因(β-galatosidase，β-gal)  51
      1.3 β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，β-GUS)报告基因  51
      1.4 分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)报告基因  51-52
      1.5 荧光素酶(luciferase，Luc)报告基因  52
      1.6 绿荧光蛋白(green fluorescent proteins，GFP)报告基因  52-53
    2 GFP的研究进展  53-59
      2.1 GFP的理化特性  54-56
        2.1.1 GFP的组成  54-55
        2.1.2 GFP的发光机制  55-56
      2.2 GFP作为报告基因的优点  56-57
        2.2.1 不加任何底物，荧光性质稳定  56
        2.2.2 分子量小，对细胞无毒性  56-57
        2.2.3 使用方便，可行活细胞实时定位观察  57
        2.2.4 显著改善的荧光特性  57
      2.3 影响GFP表达强度的因素  57-59
        2.3.1 表达温度对GFP荧光强度的影响  57-58
        2.3.2 酸碱对GFP荧光强度的影响  58
        2.3.3 化学试剂对GFP荧光强度的影响  58
        2.3.4 表达时间对GFP荧光强度的影响  58-59
    3 GFP在生物学领域的应用  59-63
      3.1 转基因动物的研究  59-60
      3.2 发育分子机理研究  60
      3.3 筛选新的药物  60
      3.4 跟踪观察病原菌  60-61
      3.5 用于临床检验  61
      3.6 在基因治疗研究中的应用  61-62
      3.7 报告基因的特殊应用  62-63
    4 存在的问题及展望  63
    参考文献  63-68
试验研究  68-100
  第三章 昆明白小鼠原核胚体外培养的研究  68-76
    1 材料和方法  68-69
      1.1 小鼠的超排处理和原核胚的获得  68
      1.2 输卵管上皮共培养的制备  68
      1.3 试验设计及胚胎体外培养  68-69
      1.4 胚胎细胞染色计数及试验数据统计分析  69
    2 结果  69-72
      2.1 FBS和BSA对小鼠胚胎发育的影响  69-70
      2.2 输卵管上皮共培养对小鼠胚胎发育的作用  70-72
      2.3 胚胎体内和体外发育比较  72
    3 讨论  72-73
    参考文献  73-76
  第四章 小鼠胚胎的冷冻保存  76-82
    1 材料和方法  76-77
      1.1 冷冻液结晶变化试验分组  76
      1.2 试验动物的超排处理  76
      1.3 小鼠胚胎的收集及冷冻方法  76-77
      1.4 小鼠胚胎的解冻和体外培养  77
    2 结果  77-79
      2.1 不同植冰温度下冷冻液的结晶变化  77-78
      2.2 不同冷冻方法对小鼠胚胎冷冻效果的比较  78-79
    3 讨论  79
    参考文献  79-82
  第五章 Bcl-2／GFP融合基因表达载体的构建  82-86
    1 材料和方法  82-83
      1.1 bcl-2基因，菌株与质粒来源  82
      1.2 主要酶及试剂  82
      1.3 bcl-2基因的克隆  82-83
      1.4 bcl-2基因真核表达载体的构建  83
    2 结果  83-85
      2.1 目的基因的扩增  83
      2.2 bcl-2转基因表达载体构建  83-85
    3 讨论  85
    参考文献  85-86
  第六章 融合基因表达载体在小鼠早期胚胎的表达  86-94
    1 材科和方法  86-87
      1.1 小鼠原核卵准备  86
      1.2 注射用外源基因的制备  86
      1.3 原核卵显微注射和注射卵的体外培养  86
      1.4 早期胚胎的荧光观察  86-87
      1.5 试验设计及统计分析  87
    2 结果  87-90
      2.1 不同时期原核胚进行显微操作后的发育  87
      2.2 紫外照射对小鼠胚胎体外发育的影响  87-88
      2.3 外源基因的表达观察  88-90
    3 讨论  90-91
      3.1 不同时期原核胚显微操作后的发育的影响  90
      3.2 紫外照射对小鼠胚胎体外发育的影响  90
      3.3 外源基因表达的影响  90-91
    参考文献  91-94
  第七章 小鼠胚胎外源基因的检测和胚胎移植  94-100
    1 材料与方法  94-96
      1.1 胚胎分割及样品的制备  94
      1.2 胚胎基因组DNA的制备和PCR反应  94-95
      1.3 小鼠胚胎移植  95
        1.3.1 假孕小鼠的处理  95
        1.3.2 胚胎移植  95
      1.4 试验设计  95-96
    2 结果  96-97
      2.1 荧光观察与PCR扩增结果比较  96
      2.2 胚胎移植结果比较  96-97
    3 讨论  97-98
      3.1 关于检测早期胚胎转基因的方法  97-98
      3.2 转基因胚胎的附植发育  98
    参考文献  98-100
总结  100-102
Abstract  102-104

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 畜禽繁殖
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