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溶菌酶-绿色荧光蛋白（Lyz-GFP）双元基因对苜蓿转化的研究

作　者: 韩斌
导　师: 马晖玲
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 苜蓿 再生体系 溶菌酶Lyz基因 绿色荧光蛋白GFP基因 农杆菌介导
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 40次
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内容摘要


苜蓿(Medicago sativa L.)属豆科多年生草本,是世界上最重要的饲料作物,在苜蓿的生产实践中往往会遇到一些病原微生物的侵染而导致苜蓿病害,病害严重时造成苜蓿减产和毁灭性损伤,带来极大的生产和经济损失。将抗病基因导入苜蓿栽培品种中,可以在短期内直接地改良苜蓿的抗病性能。本论文以甘农1号杂花苜蓿和甘农3号紫花苜蓿为供试材料,研究了其再生过程中的若干影响因素,探讨并掌握了再生条件,确定了适合2种苜蓿植株再生的最佳培养基;同时利用农杆菌介导法将绿色荧光蛋白(GFP)基因标记的抗病基因-溶菌酶(Lyz)基因导入到2个品种的苜蓿中,系统地研究了基因转化条件,建立了适宜的转化体系,进一步通过荧光显微镜和PCR检测,证实Lyz-GFP双元基因已经成功转入2种苜蓿中。主要研究内容和结果如下:1.再生体系的建立。以甘农1号和甘农3号苜蓿为供试材料,进行了其愈伤组织诱导、分化及生根的研究。结果表明:下胚轴为甘农1号杂花苜蓿和甘农3号紫花苜蓿再生的最佳外植体;最适诱导培养基为MS+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT+0.7 %琼脂+2.5 %蔗糖,诱导时间为30 d;最佳的芽分化培养基为MS+0.3 mg/L NAA+0.7 %琼脂+2.0 %蔗糖;最佳生根培养基为1/2MS+0.3 mg/L NAA+0.7 %琼脂+2.0 %蔗糖。甘农1号最佳愈伤组织诱导率和分化率分别为100%和28 %,而甘农3号的最佳愈伤组织诱导率和分化率分别为100 %和25 %。2.农杆菌介导的基因转化及转化体系的建立。以培养7～10 d的2个苜蓿品种的无菌苗下胚轴为外植体,以农杆菌菌株为介体,进行了Lyz-GFP双元基因的转化,获得了优化的基因转化体系:Kan的筛选浓度为75 mg/L,筛选方法为延迟选择;抑菌素选择Cef较好,浓度为300 mg/L;外植体预培养和共培养时间同为3 d;用于转化的侵染方式和时间为摇床上摇动10 min,适宜的菌液浓度为OD600=0.4～0.5。本研究最终得到4株甘农1号抗性苗和6株甘农3号抗性苗,其中2株甘农1号和4株甘农3号苜蓿有绿色荧光表达,转化率分别为50 %和67 %。3.转化愈伤组织的荧光检测和PCR鉴定。将获得的转化愈伤组织和植株进行了荧光检测和PCR扩增。经荧光检测,2株甘农1号和4株甘农3号苜蓿均有绿色荧光的表达。PCR鉴定结果显示,在甘农1号杂花苜蓿和甘农3号紫花苜蓿愈伤组织中均出现片段大小为750 bp的条带,双重检测结果证明外源基因Lyz-GFP已成功转入甘农1号杂花苜蓿和3号紫花苜蓿愈伤组织中。

全文目录


本研究由以下课题资助  2-3
英文缩略语  3-4
摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
前言  8-12
第一章 文献综述  12-29
  1 生物技术在苜蓿育种工作中的研究进展  12-18
    1.1 生物技术在育种中的作用  12-14
      1.1.1 改良品质  12
      1.1.2 抗逆性  12-13
      1.1.3 转抗除草剂基因苜蓿的研究  13
      1.1.4 转抗病毒基因苜蓿的研究  13-14
      1.1.5 抗虫性转基因苜蓿的研究  14
    1.2 紫花苜蓿基因转化受体系统研究进展  14-15
      1.2.1 原生质体受体系统  14
      1.2.2 愈伤组织受体系统  14-15
      1.2.3 直接分化受体系统  15
      1.2.4 胚状体再生受体系统  15
    1.3 苜蓿基因转化方法  15-17
      1.3.1 电击法介导的DNA 直接转移导入原生质体  15-16
      1.3.2 显微注射法  16
      1.3.3 基因枪转化法  16
      1.3.4 农杆菌介导法  16-17
    1.4 发展转基因苜蓿的限制因素  17
      1.4.1 基因发现和描述比例  17
      1.4.2 基因沉默现象  17
      1.4.3 生物安全问题  17
      1.4.4 知识产权问题  17
    1.5 转基因苜蓿的发展趋势和应用前景  17-18
  2 绿色荧光蛋白（GFP）研究进展及应用  18-24
    2.1 GFP 的研究进展及特性  18-20
      2.1.1 GFP 的研究进展  18-19
      2.1.2 GFP 的理化性质  19
      2.1.3 GFP 的发光机理  19-20
    2.2 GFP 的荧光性质及应用优点  20-21
    2.3 GFP 在植物研究中的应用  21-23
      2.3.1 GFP 作为报告基因用于转基因工作  21
      2.3.2 GFP 作为报告蛋白用于基因表达的调控效果研究  21-22
      2.3.3 GFP 在基因产物及基因定位研究中的应用  22
      2.3.4 GFP 用于研究植物与微生物的关系  22-23
      2.3.5 GFP 用于完整植株的信号传导研究  23
    2.4 GFP 的荧光检测  23
    2.5 GFP 应用中的注意事项  23-24
  3 溶菌酶研究进展  24-27
    3.1 溶菌酶性质及抗菌机制  24-25
      3.1.1 溶菌酶性质  24-25
      3.1.2 溶菌酶的抗菌作用机制  25
    3.2 溶菌酶种类  25-26
      3.2.1 动物溶菌酶  25
      3.2.2 植物溶菌酶  25
      3.2.3 微生物溶菌酶  25-26
    3.3 溶菌酶在应用过程中的优点  26
    3.4 溶菌酶的应用  26-27
      3.4.1 溶菌酶在食品工业上的应用  26-27
      3.4.2 溶菌酶在医学上的应用  27
      3.4.3 溶菌酶在生物工程中的应用  27
  4 研究目的与意义  27-29
第二章 不同品种苜蓿再生体系的建立  29-40
  1 材料和方法  29-32
    1.1 材料  29
    1.2 试验方法  29-32
      1.2.1 无菌苗的获得  29
      1.2.2 苜蓿愈伤组织的诱导  29-31
      1.2.3 苜蓿愈伤组织的分化  31
      1.2.4 生根培养  31
      1.2.5 再生苗移栽  31-32
      1.2.6 统计方法  32
  2 结果与分析  32-38
    2.1 苜蓿愈伤组织的诱导  32-35
      2.1.1 不同部位的外植体诱导  32-33
      2.1.2 不同浓度的2，4-D 对诱导愈伤的影响  33
      2.1.3 不同浓度6-BA 对诱导愈伤的影响  33-34
      2.1.4 不同浓度KT、NAA 组合对诱导愈伤的影响  34-35
    2.2 苜蓿愈伤组织的分化  35-37
      2.2.1 愈伤组织诱导时间对分化的影响  35-36
      2.2.2 不同浓度KT 和NAA 组合对分化的影响  36-37
    2.3 诱导生根  37-38
    2.4 再生苗移栽  38
  3 讨论  38-39
    3.1 苜蓿再生外植体的选择  38
    3.2 褐化现象  38-39
    3.3 激素浓度对苜蓿再生的影响  39
  4 小结  39-40
第三章 PBI121-Lyz-GFP 双元基因对苜蓿的遗传转化  40-55
  1 材料和方法  40-46
    1.1 试验材料  40
    1.2 试剂与培养基  40-41
      1.2.1 培养基  40-41
      1.2.2 抗生素  41
    1.3 试验方法  41-46
      1.3.1 农杆菌的活化与保存  41
      1.3.2 菌液的制备  41
      1.3.3 无菌苗的获得  41-42
      1.3.4 外植体的获得  42
      1.3.5 侵染  42
      1.3.6 农杆菌介导转化体系的建立  42-43
      1.3.7 转基因苜蓿的鉴定  43-46
  2 结果与分析  46-52
    2.1 农杆菌介导转化体系的建立  46-49
      2.1.1 卡那霉素对“甘农1 号”杂花苜蓿和“甘农3 号”紫花苜蓿愈伤组织诱导和生长的影响  46-47
      2.1.2 抗生素的抑菌效果及其对苜蓿愈伤组织诱导和生长的影响  47
      2.1.3 预培养时间对苜蓿愈伤组织诱导的影响  47-48
      2.1.4 侵染时间和方式对苜蓿愈伤组织诱导的影响  48
      2.1.5 菌液浓度对转化效率的影响  48-49
    2.2 转基因苜蓿的鉴定  49-51
      2.2.1 愈伤组织的荧光检测  49-50
      2.2.2 胚性愈伤组织PCR 检测  50
      2.2.3 转基因苜蓿植株的荧光检测  50-51
    2.3 不同发育时期苜蓿转化组织中的GFP 基因荧光表达量分析  51-52
  3 讨论  52-54
    3.1 预培养对农杆菌介导转化率的影响  52
    3.2 农杆菌介导的基因转化中适宜条件的确立  52-53
    3.3 筛选方式对转化率的影响  53
    3.4 荧光蛋白基因在基因表达检测中具有突出的优点  53
    3.5 处于不同生长时期的苜蓿转化组织荧光表达量的差异  53-54
  4 小结  54-55
参考文献  55-60
致谢  60-61
作者简介  61-62
导师简介  62-63

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 饲料作物、牧草 > 多年生豆科牧草 > 其他
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