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几种病程相关蛋白基因转化番茄的研究

作　者: 欧阳波
导　师: 叶志彪；傅廷栋
学　校: 华中农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄(Lyeopersicon esculentum Mill.) 农杆菌介导的转化几丁质酶 β-1，3-葡聚糖酶烟草AP24
分类号: S641.2
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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引　用: 9次
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内容摘要

真菌病害严重影响农作物产量和农产品品质，有的病原真菌分泌毒素污染粮食直接损害人体健康。栽培措施和化学农药防治真菌病害的能力有限，化学农药还造成严重的环境污染，抗病育种成为解决农作物病害问题的必然选择。传统育种由于周期长和物种间的生殖隔离等问题而面临挑战。转基因技术成为克服其缺点的一个重要选择，基因工程技术为选育抗病新品种，解决农作物病害问题开辟了新道路。番茄是广受欢迎的一种水果型蔬菜，同时也是植物基因工程研究的一种模式作物。番茄生产受到数十种病原真菌的危害，抗真菌病害研究成为番茄抗病育种的重要方面，协同表达植物防卫基因是一个被看好的选育抗真菌新品种的研究策略。本研究利用农杆菌介导的转基因方法，针对三种病程相关蛋白基因—菜豆几丁质酶基因(Chi)、烟草β-1，3-葡聚糖酶基因(Glu)和烟草PR5类基因AP24，在番茄品种A53和中蔬5号上进行了抗真菌转基因研究，获得的主要结果如下： 1．研究了玉米素和IAA对番茄子叶再生的影响。结果表明高浓度玉米素诱导畸形再生芽发生，抑制再生芽生根。在玉米素0.2 mg／L和IAA 1.0 mg／L时，A53正常芽的再生频率最高，达到39.7％。 2．改进了番茄的转化方法。采用两阶段选择培养，前期使用高浓度玉米素(2.0mg／L)促进细胞分化，后期降低玉米素浓度至0.2mg／L，同时增加高水平的IAA(1.0mg／L)。这一方法提高了外植体转化效率，同时缩短了转化植株的生根周期。 3．获得109棵转化植株，其中由A53获得67株，包括转化AP24／Chi的44株和转化Chi／Glu的23株；由中蔬5号获得42棵转化植株，包括转化AP24／Chi的34株和转化Chi／Glu的8株。在导入Chi／Glu的23棵A53植株中，由下胚轴再生而来的有6株。并初步调查了转基因番茄植株的倍性变异情况，结果表明转基因植株加倍率约为8％。 4．PCR检测表明转基因植株阳率为93％；Southern blot结果表明，外源基因已整合到番茄基因组中，其拷贝数1-8个不等。 5．部分转基因植株的Northern blot和抗病性鉴定表明，多数转基因植株外源基因得到了表达，有些植株表现出抗性的明显提高；同时，也有少数的植株表现出外源基因沉默现象。 6．采用TAIL-PCR技术研究了转基因植株中T-DNA右边界的侧翼序列，测序结果进一步确定了外源基因的整合，同时发现T-DNA在整合中出现超界转移和缺失插入等特殊现象。改进和发展了W己ide等的卡那霉素喷施筛选阳性转基因番茄植株的方法，使其能够在温室或田间大规模用于阳性植株的早期鉴定、转基因株系的分离研究和纯合株系的获得。构建了外源基因AP24的大肠杆菌表达载体，为下一步从蛋白质水平检测转基因植株的表达情况奠定基础。利用简并引物，从番茄基因组中扩增到AP24同源基因p;p23的完整CDS，可用于抗病转基因研究。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略词表  10-12
1 文献综述  12-34
  1.1 引言  12-13
  1.2 植物与病原的相互作用  13
  1.3 植物的抗病机制  13-15
  1.4 抗性基因的特性  15-17
    1.4.1 抗病基因  15-16
    1.4.2 防卫基因  16-17
  1.5 植物几丁质酶及其基因的研究  17-21
    1.5.1 植物几丁质酶  17-19
    1.5.2 植物几丁质酶基因的分离克隆  19
    1.5.3 几丁质酶转基因植物  19-21
  1.6 植物葡聚糖酶及其基因的研究  21-24
    1.6.1 植物β-1，3-葡聚糖酶  21-22
    1.6.2 植物β-1，3-葡聚糖酶的结构  22-23
    1.6.3 植物β-1，3-葡聚糖酶基因的表达调控  23
    1.6.4 植物β-1，3-葡聚糖酶及其基因的进化  23-24
    1.6.5 植物β-1，3-葡聚糖酶转基因植物  24
  1.7 烟草AP24及其基因的研究  24
  1.8 植物转基因研究  24-26
    1.8.1 研究进展概况  24-25
    1.8.2 番茄转基因研究  25-26
  1.9 外源基因的表达  26-29
    1.9.1 外源基因的沉默  26-28
    1.9.2 消除外源基因沉默的可能策略  28-29
  1.10 T-DNA侧翼序列的分析  29-30
    1.10.1 I-PCR  29-30
    1.10.2 TAIL-PCR  30
  1.11 提高植物抗病性的策略  30-32
  1.12 本课题的研究目的和意义  32-34
2 材料和方法  34-54
  2.1 材料  34-36
    2.1.1 植物材料  34
    2.1.2 农杆菌和植物表达载体  34-35
    2.1.3 大肠杆菌和克隆载体  35-36
    2.1.4 主要试剂  36
  2.2 方法  36-54
    2.2.1 番茄的遗传转化  36-39
      2.2.1.1 番茄子叶再生体系的优化(培养基见表2.1)  36-37
      2.2.1.2 番茄子叶和下胚轴的转化(培养基见表2.1)  37-39
      2.2.1.3 转基因植株倍性变异调查  39
    2.2.2 转基因植株分子鉴定  39-43
      2.2.2.1 番茄基因组DNA的提取  39
      2.2.2.2 转基因植株PCR检测  39-40
      2.2.2.3 Southern杂交分析  40-42
      2.2.2.4 总RNA的提取  42
      2.2.2.5 Northern杂交分析  42-43
    2.2.3 转基因植株的抗病性鉴定  43-45
    2.2.4 T-DNA右边界侧翼序列分析  45-50
    2.2.5 外源基因性状分离调查方法的研究  50
    2.2.6 外源基因的融合蛋白表达载体构建  50-52
    2.2.7 番茄内源相关基因的克隆  52-54
3 结果与分析  54-82
  3.1 外植体再生和遗传转化  54-59
    3.1.1 番茄子叶再生体系的优化  54-57
      3.1.1.1 细胞分裂素对再生芽形成的影响  54-55
      3.1.1.2 低水平Zt与高水平IAA促进再生芽形成  55-56
      3.1.1.3 低水平Zt与高水平IAA促进再生芽根的形成  56-57
    3.1.2 子叶和下胚轴转化获得Km抗性植株  57-59
  3.2 转基因植株分子鉴定  59-65
    3.2.1 转基因植株PCR检测  59-60
    3.2.2 Southern Blot分析  60-63
    3.2.3 转基因植株Northern Blot分析  63-65
  3.3 转基因植株的抗病性鉴定  65-68
    3.3.1 转基因番茄抗枯萎病试验  65-67
    3.3.2 转基因番茄抗早疫病试验  67-68
  3.4 T-DNA整合位点的上游序列  68-76
    3.4.1 TAIL-PCR扩增及特异产物的克隆  68-71
    3.4.2 TAIL-PCR产物测序结果分析  71-74
    3.4.3 T-DNA整合中的特殊现象  74-76
  3.5 外源基因性状分离调查方法  76-77
  3.6 外源基因的原核表达载体构建  77-80
  3.7 番茄内源抗病相关基因的克隆  80-82
4 讨论  82-90
参考文献  90-105
APPENDIX  105-111
致谢  111

几种病程相关蛋白基因转化番茄的研究

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