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硫化叶菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的克隆、表达与功能分析

作　者: 朱泾
导　师: 梁运祥
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 硫化叶菌 甘露聚糖酶 内切β-1，4-葡聚糖酶 DNS法 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


β-甘露聚糖酶和内切p-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,广泛的应用于饲料业、造纸业、啤酒工业等领域。为了满足生产的要求,对工业用酶耐热耐酸高活性方面的研究日益增多。木研究的主要目的是,从极端微生物中挖掘一些有潜在工业价值的嗜热酶,尝试利用冰岛硫化叶菌蛋白表达系统,探索这些嗜热酶在工业化应用中的可行性。本研究获得如下结果：(1)利用PCR技术从冰岛硫化叶菌REY15A (S. islandicus Rey15A)中分别扩增得到带有和不带有信号肽编码序列的内切p-1,4-内切葡聚糖酶基因(Sis eng),并将其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pZC2-eng-YS和pZC2-eng-WS,并转化至S.islandicus E233S (△pyrEF△lacS)。重组菌株经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化,得到重组蛋白。SDS-PAGE结果表明不带有信号肽的葡聚糖酶(ENG-W)分子量为41 ku,带有信号肽的分子量(ENG-SP)为43 ku。酶学性质分析表明前者没有酶活性；后者酶活力为103.4 U/L,最适反应温度为90℃,最适pH为4.0,耐热性实验结果表明在90℃保温60 min后酶活力稳定在最高酶活力的40%以上；金属离子实验结果表明,终浓度为1mmol/L的Mn2+对重组酶促进作用最大,使其酶活力提高了约59%,终浓度为1mmol/L的Ca2+对其抑制作用最强,使其酶活力下降至43%。(2)利用PCR技术从硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2)中扩增得到内切甘露聚糖酶基因,并将其分别克隆至大肠杆菌表达载体pET-30α和硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pET-30α-3007和pZC2-3007,并分别转化至E. coli Rosetta和S.islandicus E233S(△pyrEF△lacS)菌中。利用IPTG诱导重组菌株E.coli Rosetta/pET-30α-3007, SDS-PAGE检测表明目的蛋白大部分以包涵体形式存在且分子量大小为70 ku,与预测一致；对其进行包涵体复性后过Ni-NTA柱纯化得到目的蛋白3007-R。重组菌株S. islandicus E233S/pZC2-3007经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化,得到重组蛋白3007-S。酶学性质分析表明重组蛋白3007-R和3007-S均没有甘露聚糖酶活性,实验结果证实在此实验条件下Sso3007不具有NCBI上预测的甘露聚糖酶活性。质谱分析重组蛋白3007-S,结果表明基因序列均全部表达。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语表  9-10
1 前言  10-19
  1.1 硫化叶菌及穿梭质粒pZC2简介  10-13
    1.1.1 古菌简介  10-11
    1.1.2 硫化叶菌简介  11-12
    1.1.3 穿梭质粒pZC2简介  12-13
  1.2 大肠杆菌Rosetta的菌株表达系统及表达载体简介  13-14
  1.3 β-1,4-葡聚糖酶及β-葡聚糖简介  14-16
    1.3.1 β-葡聚糖  14-15
    1.3.2 β-1,4-葡聚糖酶  15
    1.3.3 β-葡聚糖酶的应用  15-16
  1.4 β-甘露聚糖及甘露聚糖酶简介  16-18
    1.4.1 β-甘露聚糖  16-17
    1.4.2 β-甘露聚糖酶简介  17-18
    1.4.3 甘露聚糖酶在工业中的应用  18
  1.5 研究目的及内容  18-19
2 材料与方法  19-35
  2.1 材料  19-21
    2.1.1 菌株与质粒  19
    2.1.2 试剂与工具酶  19-20
    2.1.3 培养基和部分溶液的配制  20-21
    2.1.4 仪器设备  21
  2.2 硫化叶菌基因组的提取  21-22
  2.3 内切β-1,4-葡聚糖酶的研究  22-28
    2.3.1 内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆  22-23
    2.3.2 表达载体的构建  23-24
    2.3.3 内切β-1,4-葡聚糖酶表达与纯化  24-27
    2.3.4 内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质研究  27-28
  2.4 甘露聚糖酶的研究  28-35
    2.4.1 甘露聚糖酶基因的克隆  28-30
    2.4.2 表达载体的构建  30-31
    2.4.3 甘露聚糖酶在大肠杆菌中的表达与纯化  31-33
    2.4.4 甘露聚糖酶在硫化叶菌中的表达与纯化  33
    2.4.5 甘露聚糖酶的活性检测  33-34
    2.4.6 重组蛋白的质谱检测  34-35
3 结果与分析  35-48
  3.1 内切β-1,4-葡聚糖酶的研究  35-42
    3.1.1 内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆  35
    3.1.2 表达载体的构建  35-36
    3.1.3 内切β-1,4-葡聚糖酶基因的表达与纯化  36-39
    3.1.4 内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质研究  39-42
  3.2 甘露聚糖酶的研究  42-48
    3.2.1 甘露聚糖酶基因的克隆  42
    3.2.2 表达载体的构建  42-44
    3.2.3 甘露聚糖酶在大肠杆菌中的表达与纯化  44-45
    3.2.4 甘露聚糖酶在硫化叶菌中的表达与纯化  45-46
    3.2.5 重组蛋白的活性及质谱检测  46-48
4 讨论  48-50
  4.1 硫化叶菌表达系统  48
  4.2 内切β-1,4-葡聚糖酶的研究  48-49
  4.3 甘露聚糖酶的研究  49-50
参考文献  50-54
附录  54-56
  Mascot Search Results  54-55
  Transetta(DE3)Chemically Competent Cell  55-56
致谢  56

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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