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梨抗病相关基因的克隆及表达检测

作　者: 刘栋峰
导　师: 王跃进
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 园艺植物种质资源学
关键词: 梨梨黑星病几丁质酶基因 β-1,3-葡聚糖酶基因基因表达
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

梨黑星病是由梨黑星病菌(Venturia nashicola Tanaka et Yamamoto.)引起的一种重要的真菌病害,在我国各梨区普遍发生,在梨的生产上造成很大的经济损失。本研究从对黑星病抗性强的黄冠梨品种中克隆获得几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA片段,进一步采用RACE技术获得基因全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析所得基因序列和肽链结构;同时检测所获得的基因在梨黑星病病原菌诱导和水杨酸诱导下的表达变化。取得的主要研究结果有:1、黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析根据几丁质酶基因序列,设计特异性引物,以黄冠梨品种叶片为材料,经提取总RNA和反转录,克隆到5个几丁质酶基因cDNA片段,通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、PyChi2、PyChi3、PyChi4和PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为:FJ589783、FJ589784、FJ589785、FJ589786和FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其它植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在53%~35%之间;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着显著的差异。2、黄冠梨β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长序列克隆与分析根据已知β-1,3-葡聚糖酶基因,设计特异性引物,同样以黄冠梨品种叶片为材料,提取RNA和反转录,克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,命名为PyGlu,序列提交GenBanK,登录号为:FJ589788。序列分析结果表明,所获得β-1,3-葡聚糖酶基因,具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性。3、早酥梨几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在黑星病菌后诱导后的表达变化用1.5×10~5个/mL的黑星病菌孢子悬浮液,喷施接种于梨树幼苗叶片上,采样共分为7个时期:未处理(CK)、0.5d、1d、2d、3d、5d、7d。RT-PCR方法检测结果表明,在接种黑星病菌后,PyChi1基因为先减弱后增加再减弱, PyChi3和PyChi5基因表达变化不明显。PyChi2、PyChi4和PyGlu基因在接种病菌后表达量呈现先上升后逐渐减弱趋势。试验结果表明,在接种黑星病菌的叶片中,PyChi1、PyChi2、PyChi4和PyGlu基因的表达发生了明显的变化。4、早酥梨几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在水杨酸诱导后叶片中的表达变化用5 mmol/L浓度水杨酸进行叶面喷雾处理,材料采集与接种病菌处理一样。采用RT-PCR方法检测结果表明:PyChi1基因在水杨酸处理12小时后的表达量高于未接种前,然后表达减弱,在第3天和第5天出现表达高峰,第7天回到初始水平。PyChi2和PyChi5基因变化不明显。PyChi3基因在水杨酸处理后12小时的表达量显著地高于未处理时,然后逐渐减弱。PyChi4基因为先减弱再增加。PyGlu基因在水杨酸处理的叶片中的表达变化为:先减弱,后增加,再减弱,第7天减弱至低于未处理时的表达量。试验结果表明,水杨酸对PyChi1、PyChi3、PyChi4和PyGlu基因起了诱导作用。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章文献综述  10-21
  1.1 植物几丁质酶基因的研究进展  10-14
    1.1.1 植物中几丁质酶的结构和分类  10-11
    1.1.2 植物几丁质酶的生物学功能  11-12
    1.1.3 植物几丁质酶基因的表达调控  12-14
  1.2 植物β-1,3-葡聚糖酶基因的研究进展  14-16
    1.2.1 β-1,3-葡聚糖酶的性质和分类  14
    1.2.2 β-1,3-葡聚糖酶基因的诱导产生  14-15
    1.2.3 β-1,3-葡聚糖酶基因抗病机制和应用  15-16
  1.3 cDNA 末端快速扩增(RACE)技术  16-19
    1.3.1 全长cDNA 克隆的策略  16
    1.3.2 RACE 技术的原理  16-17
    1.3.3 RACE 技术的缺点及改进  17-19
  1.4 梨黑星病研究概况  19
  1.5 本研究的目的和意义  19-21
第二章材料与方法  21-29
  2.1 材料与试剂  21
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 主要试剂  21
    2.1.3 试验仪器  21
  2.2 方法  21-29
    2.2.1 黑星病菌接种和水杨酸诱导与取样  21-22
    2.2.2 引物设计  22-23
    2.2.3 RNA 的提取及检测  23-24
    2.2.4 克隆黄冠梨几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA 片段  24-25
    2.2.5 获得黄冠梨几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA 序列  25-26
    2.2.6 PCR 产物回收，连接，转化，克隆和测序  26-27
    2.2.7 核酸及蛋白序列的生物信息学分析  27-28
    2.2.8 RT-PCR 检测基因表达  28-29
第三章结果与分析  29-39
  3.1 梨叶片总RNA 的提取  29
  3.2 黄冠梨几丁质酶基因全长cDNA 序列的获得  29-30
    3.2.1 黄冠梨几丁质酶基因cDNA 片段的克隆  29
    3.2.2 黄冠梨几丁质酶基因RACE-PCR  29-30
    3.2.3 黄冠梨几丁质酶基因序列拼接结果  30
  3.3 黄冠梨β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA 序列的获得  30-31
    3.3.1 黄冠梨β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA 片段的克隆  30-31
    3.3.2 黄冠梨β-1,3-葡聚糖酶基因RACE-PCR  31
  3.4 核酸及蛋白序列的生物信息学分析  31-37
    3.4.1 黄冠梨几丁质酶基因的生物信息学分析  31-35
    3.4.2 黄冠梨β-1,3-葡聚糖酶基因的生物信息学分析  35-37
  3.5 RT-PCR 检测基因表达  37-39
    3.5.1 早酥梨几丁质酶基因表达检测  37-38
    3.5.2 早酥梨β-1,3-葡聚糖酶基因表达检测  38-39
第四章讨论  39-42
  4.1 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病性  39-40
  4.2 几丁质酶基因的结构与分类  40-41
  4.3 关于基因家族的克隆策略  41-42
第五章结论  42-43
参考文献  43-50
附录  50-55
致谢  55-56
作者简介  56

梨抗病相关基因的克隆及表达检测

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