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绿僵菌对蜱致病因子的分析和初步应用

作　者: 王子坚
导　师: 罗建勋；曾巧英；殷宏
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 绿僵菌微小牛蜱蛋白酶几丁质酶致病力增效作用
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 19次
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内容摘要

蜱隶属于蜱螨目、蜱总科,寄生于动物体表,广泛分布于我国各省区,是严重危害畜牧业生产的一类外寄生虫,不仅可通过叮咬吸血导致动物生产性能的下降,还可以传播动物和人的多种传染病（包括病毒病和细菌病）和寄生虫病（如:泰勒虫病和巴贝斯虫病）,给畜牧业造成严重经济损失。目前对蜱的防制方式主要以化学药物防治为主,但随着蜱耐药性的产生以及人们对环境污染和药物残留等公共卫生问题的关注,该方法的应用在一定程度上受到限制,人们越来越将目光转移到免疫预防和生物防治等绿色控制方法上来。致病性病原真菌作为一种很有潜力的生物控制因子,已在农业害虫生物防治领域得到广泛地应用,而在兽医线虫和外寄生虫病防治的研究才刚刚起步。本文以对蜱具有高致病力的菌株为研究对象,研究其毒力因子——胞外蛋白酶和几丁质酶与致病力之间的相关性;对发酵条件进行优化,摸索绿僵菌的产酶最佳条件,制备粗酶制剂;将其与微生物农药Bt进行配伍,观察协同作用效果。主要研究结果如下:1﹑观察了10株绿僵菌对微小牛蜱饥饿幼虫的致病性作用,通过生物测定,得知Ma002菌株对微小牛蜱饥饿幼虫致病力最高,致死率达到82.1%。半数致死时间最短的是Ma002的LT₅₀为4.83 d;所以将Ma002作为所选菌株。测定了10株绿僵菌的蛋白酶和几丁质酶的活性,用生物统计学的方法分析了其与菌株对蜱的毒力之间的关系,相关系数r₁=0.8183,r₂=0.6828。结果表明,绿僵菌对微小牛蜱饥饿幼虫的毒力与其胞外酶之间呈现正向相关,并发现几丁质酶与菌株毒力之间的相关性要明显高于蛋白酶（r1>r2）,检验结果极显著。2﹑应用微生物发酵的方法研究了Ma002产几丁质酶的培养特性。Ma002产几丁质酶的最佳组分为:胶体几丁质为碳源,蛋白胨为氮源,0.05% MgSO₄·7H₂O,0.001%ZnSO₄·7H₂O。优化的培养条件:装基量12%、24 h的种子液、起始pH值7.5、发酵温度26℃、搅拌速度180 r/min、产酶时程96 h。通过条件优化,产酶菌株Ma002酶活力从1.67 U/mL提高到2.63 U/mL,酶活力提高57%。3﹑观察了几丁质酶作为一种生物添加剂与Bt农药配伍的增效作用。结果显示,随着几丁质酶溶液浓度的提高,混合药液的杀虫效果也随之提高。当在1.6×10² mg/kg浓度的Bt溶液中添加浓度为2 U/mL的酶时,杀虫效果最强,累计死亡率从52%提高到85.8%,表明几丁质酶可以作为一种增效剂,提高微生物农药的作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一篇文献综述  8-23
  1 研究目的和意义  8-9
  2 绿僵菌对蜱生物防控的研究进展  9-23
    2.1 对蜱有致病性作用的真菌  9-10
    2.2 绿僵菌的分类及对蜱的生物防治现状  10
    2.3 绿僵菌对蜱的致病机理  10-14
    2.4 绿僵菌侵染过程中的主要毒力因子  14-19
      2.4.1 胞外蛋白酶  14-15
      2.4.2 胞外蛋白酶与致病性昆虫真菌毒力之间的相关性  15-16
      2.4.3 几丁质酶  16-17
      2.4.4 几丁质酶基因工程菌的研究与毒力的相关性  17-19
    2.5 侵染机制  19-20
    2.6 增强感染效率的策略  20-23
第二篇研究报告  23-44
  第一章绿僵菌对蜱致病因子的分析  23-31
    1 材料与方法  24-28
      1.1 供试菌株  24
      1.2 供试蜱种  24
      1.3 仪器与试剂  24
      1.4 PDA 培养基  24
      1.5 蛋白酶诱导培养基  24
      1.6 几丁质酶基础培养基  24
      1.7 几丁质酶诱导培养基  24-25
      1.8 分生孢子悬液的制备  25
      1.9 生物测定  25
      1.10 高毒力绿僵菌半数致死浓度（LC50）的确定  25
      1.11 胞外蛋白酶的诱导培养和活性测定  25
      1.12 胞外几丁质酶的诱导培养和活性测定  25-28
    2 结果  28-29
      2.1 微小牛蜱幼虫高致病性绿僵菌菌株的筛选  28
      2.2 绿僵菌胞外蛋白酶和几丁质酶活性对微小牛蜱幼蜱毒力的相关性分析  28-29
    3 讨论  29-31
  第二章几丁质酶高产绿僵菌Ma002 菌株发酵条件优化  31-38
    1 材料与方法  31-32
      1.1 菌种  31
      1.2 试剂  31-32
      1.3 培养基  32
      1.4 几丁质酶活性测定  32
        1.4.1 平板透明圈法测定酶活性  32
        1.4.2 DNS 法测定酶活性  32
    2 结果  32-36
      2.1 温度对产酶活力的影响  33-34
      2.2 pH 值对产酶活力的影响  34
      2.3 培养基装基量对产酶活力的影响  34
      2.4 碳源对产酶活力的影响  34
      2.5 氮源对产酶活力的影响  34
      2.6 培养基中C/N 对产酶活力的影响  34-35
      2.7 金属离子对产酶活力的影响  35-36
      2.8 产酶时程对产酶活力的影响  36
      2.9 转速对产酶的影响  36
      2.10 菌种种龄对产酶活力的影响  36
      2.11 表面活性剂对酶活力的影响  36
    3 讨论  36-38
  第三章绿僵菌Ma002 几丁质酶对Bt 杀虫剂的增效作用  38-43
    1 材料和方法  38-40
      1.1 苏云金芽孢杆菌（绿盾高效Bt）  38
      1.2 几丁质酶的制取  38-39
      1.3 几丁质粗酶制剂的制取  39
      1.4 酶活测定  39
      1.5 几丁质酶对Bt 的增效试验  39
      1.6 几丁质酶浓度测定  39-40
    2 结果  40-42
      2.1 Ma002 产几丁质酶  41
      2.2 几丁质酶对Bt 作用效果的影响  41-42
    3 讨论  42-43
  第四章全文结论  43-44
参考文献  44-52
致谢  52-53
个人简介  53-54
导师简介  54-55

绿僵菌对蜱致病因子的分析和初步应用

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