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普通棉耳狨猴死亡病毒病因及与人群关系的研究

作　者: 石建党
导　师: 李晓眠
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 普通棉耳狨猴急性呼吸道感染呼吸道病毒血凝素－神经氨酸酶血凝试验血凝抑制试验 RT-PCR BLAST 仙台病毒副流感病毒基因克隆同源性分析
分类号: R-332
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
下　载: 58次
引　用: 8次
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内容摘要

普通棉耳狨猴与人类的亲缘关系相近，加上体小、易饲养、好管理等优点，已广泛用于医学领域的研究。1987年天津医科大学从国外引进普通棉耳狨猴，用于地方病的基础研究，取得了满意的成果。经过努力已成功地繁育了第一代和第二代，使年拥有量在100只以上，成为国内目前唯一较为庞大的群体，并已向国家八五、九五攻关课题提供动物，产生了较大的社会效益和经济效益。 1999年6月，该动物中心饲养的普通棉耳狨猴群体中暴发急性呼吸道传染病，发病率几乎100％，死亡率达33％。本次发病具有明显的呼吸道病毒感染特征：突然暴发，迅速蔓延，发病率高并伴有一定的死亡率。为发展和保护我国唯一的狨猴种群基地，并了解病原体与人类的关系，我们对狨猴死亡的病因进行了深入研究。第一部分研究主要是进行病毒分离及病原学鉴定。在排除细菌感染的基础上，通过死亡狨猴肺组织匀浆接种鸡胚和MDCK细胞的分离培养，分离出一株具有很高血凝效价的病毒株。通过双份血清试验及动物接种试验，发现：(1)发病狨猴恢复期血清对分离病毒抗体效价有4倍以上升高；(2)分离病毒接种狨猴，狨猴出现呼吸道症状，4周后血清抗体与接种前相比有60倍以上升高；(3)分离病毒接种SPF小鼠，从死亡小鼠肺组织可分离出与接种病毒一致的病毒。确认该病毒是本次疾病流行的病原体。我们在初步分析本次疾病流行规律的同时，发现动物中心工作人员都有此病原体的抗体，并且在正常人群(献血员)中也有此病毒的抗体，阳性率高达 46．7％门人提示此病原体与人类有密切的关系，可能是一株人和诫猴共患的呼吸道病毒。第二部分研究的目的是对分离到的病原体进行进一步鉴定。采用6种能够获得的呼吸道病毒标准血清及标准毒株（甲型流感HINI、 H3NZ；乙型流感BIBeijingl243197、BIBJll84193！the；新城疫病毒；仙台病毒）用交叉血凝抑制试验对分离毒株进行鉴定，发现该毒株与仙台病毒血清学特征最为接近，但与乙型流感病毒等也有交叉反应。将病毒液浓缩后用磷钨酸负染，电镜观察进行形态学鉴定，分离毒株核衣壳结构明显，具有典型的副粘病毒特征。采用分子生物学方法，设计出 Inf A、Inf B、hPIV、仙台病毒、hPIVZ、 SVS、hPIV3和hPIV4等8对可能病毒的特异性PCR引物，用RTPCR技术检测病毒基因组，发现只有仙台病毒的引物能够扩增出相应分子量大小的产物。扩增产物经过序列测定后，用生物信息学方法与各基因库中核酸序列进行比较，确认该分离毒株是副流感1型病毒中的仙台病毒。第三部分主要是进行分离病毒与人群关系的研究，克隆病毒的HN基因并将其与人副流感1型病毒进行比较，为开发一种可用于人类也可用于诫猴疾病预防的疫苗提供理论和物质基础。我们检验了天津市53份 14周岁以下）L童血清、36份 15～50岁青、中年人血清、43份 50岁以上中、老年人血清和山西省 18份血清，抗体阳性率分别为45．28％、41．67％、60．47％和50％。经统计学检验，不同年龄、省份的人群血清中对应于仙台病毒Tiwiin株的抗体存在情况无差别，总体的抗体阳性率为 49．3 3％。提示该病毒与人关系密切。仙台病毒的HN蛋白是其主要的抗原物质，有可能作为基因疫苗的成分之一。为此，我们设计了扩增仙台病毒HN基因全部序列的PCR引物，用高保真耐热 DNA聚合酶扩增出特异性 PCR产物，然后用普通 Tq酶为产物加上突出 4的3人碱基，再用A／T连接的方式克隆到质粒载体上，并对其进行了序列测定。根据测定的核酸序列推测出它的蛋白质序列，然后与人副流感1 型病毒humMashingtonll957毒株的HN蛋白进行了同源性分析。发现它们整体同源性为 71％，包膜外区同源性高达 76％。提示我们所克隆的 HN基因有望作为一种疫苗成分同时增强人体和诫猴对这两种副流感1型病毒——仙台病毒和人副流感1型病毒的抵抗力。

全文目录

英文缩略语  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-17
第一部分病毒分离与病原学验证  17-34
  材料与方法  18-24
    —、细菌学检测  18
    二、病毒学检测  18-24
      1．病毒的分离培养  18-20
      2．分离毒株与疾病流行的关系  20-24
  结果  24-30
  讨论  30-33
  小结  33-34
第二部分病毒鉴定  34-55
  材料与方法  35-40
    一、血清学鉴定  35-36
    二、形态学鉴定  36
    三、分子生物学鉴定  36-40
      1． RT-PCR方法鉴定分离病毒株  36-39
      2．生物信息学分析  39-40
  结果  40-47
  讨论  47-54
  小结  54-55
第三部分分离病毒与人群关系的研究  55-73
  材料与方法  56-61
    一、分离病毒与人群的血清学关系  56
    二、分离病毒HN基因的克隆及与hPIV1同源性分析  56-61
      1．分离病毒HN基因的RT-PCR扩增  56-57
      2．分离病毒HN基因的克隆及测序  57-60
      3．仙台病毒Tianjin株HN蛋白与hPIV1同源性分析  60-61
  结果  61-67
  讨论  67-72
  小结  72-73
研究总结  73-74
综述  74-82
参考文献  82-96
附录：在学期间发表的论文  96-97
致谢  97

普通棉耳狨猴死亡病毒病因及与人群关系的研究

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