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副粘病毒Tianjin株全基因组测序及生物信息学分析

作　者: 石立莹
导　师: 李晓眠；李梅
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 副粘病毒仙台病毒全基因组引物步移法 RACE法生物信息学系统进化树同源性比较变异位点
分类号: R373.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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引　用: 2次
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内容摘要

副粘病毒为有包膜的负链RNA病毒，是一类重要的人类和动物致病病毒，如尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、Menangle病毒等。1999年我们从因呼吸道感染而死亡的灵长类动物狨猴肺组织中分离到一株病毒，经过一系列研究初步证实该病毒可能是一株副粘病毒，暂时命名为副粘病毒Tianjin株。在病原鉴定过程中，我们曾经通过RT-PCR方法扩增得到该毒株一段长为375 bp的片段，并将测序结果发送到互联网BLAST服务器进行联配检索，发现其与仙台病毒HN基因同源性较高，但推导出的氨基酸序列还存在较大差异。更重要的是，仙台病毒是啮齿类动物致死性病原体，然而在普通棉耳狨猴呼吸道疾病流行期间，饲养在同一实验中心的各种实验用鼠无一例发病。而且血清学调查结果显示，动物中心工作人员都有此病毒的抗体；正常人群中对此病毒的抗体阳性率高达35％；患急性呼吸道感染的儿童抗体阳性率为19.28％，说明此病毒与人类关系密切，可能是仙台病毒发生了某些变异而跨越了种属界限，形成对啮齿类动物低致病性，而对灵长类动物乃至人类高致病性的毒株；或者是一株未被发现的能引起灵长类动物及人类呼吸道感染的新的副粘病毒。为进一步明确其来源和种系进化地位，阐明与人类疾病间的关系，我们从分子水平上对该病毒进行了较为深入的研究。首先，在第一部分工作中，我们在引物步移测序策略指导下对副粘病毒Tianjin株全基因组进行了测序。根据GenBank中已发表的仙台病毒全基因组序列，设计了13对引物，以鸡胚尿囊液中提取出的病毒总RNA为模板，扩增得到13个覆盖整个基因组的相互重叠片断，同时采用3’RACE和5’RACE法对Tianjin株基因组末端序列进行扩增，经克隆、测序、拼接，最后得到了Tianjin株的全基因组序列。结果表明，副粘病毒Tianjin株基因组由15，384个核苷酸组成，与已知仙台病毒基因组长度完全相同，遵循“六碱基原则”。从基因组的3’端至5’端依次排列着3’UTR，结构基因NP、P、M、F、HN和L编码区，以及5’UTR。P基因内同样包含了另外一重叠的开放阅读框，且存在着一个保守的RNA编辑位点(RNA editing site)3’-UUUUUCCC-5’。推测除了编码NP、P、M、F、HN和L六种病毒特异性结构蛋白外，另外还可能编码C、V、W等非结构蛋白。Tianjin株各结构基因的上下游均存在着保守的基因起始信号S和终止信号E，连接E和S的是一个保守的三核苷酸间隔区GAA或GGG。但是与已知仙台病毒相比，Tianjin株基因组结构中有两处明显不同，一是在HN基因和L基因间保守的S序列中有一个碱基发生突变(A8532G)；二是L基因终止密码子突变(A15240C)，导致预测的Tianjin株L蛋白比已知仙台病毒L蛋白多了一个氨基酸。比较巧合的是，仙台病毒BB1株也在该点出现同样的突变。这些突变有可能导致Tianjin株出现一些独特的生物学特性。在本文第二部分工作中，我们对测序得到的Tianjin株全基因组序列进行了较为全面的生物信息学分析。为了确定Tianjin株在副粘病毒科中的分类地位，我们将Tianjin株与副粘病毒科25株病毒全基因组序列进行了系统进化分析，进化树显示，Tianjin株与仙台病毒、人副流感病毒1型、人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型位于同一个分支，且与仙台病毒亲缘关系最接近，说明Tianjin株在分类上属于副粘病毒科副粘病毒亚科呼吸道病毒属。进一步与GenBank中14株仙台病毒全基因组序列比较，进化树显示，Tianjin株不属于现有的三个分支，而是独立为一个分支，同源性分析同样支持这一结果，因此Tianjin株应被列为仙台病毒第四种基因型。另外，结构基因推导出的氨基酸序列同源性比较显示，P蛋白变异最大，虽然只有568 aa，却含有29个独特变异位点和35个与BB1共同具有的变异位点，与已知仙台病毒同源性仅为78.7％～91.9％。比较其他仙台病毒，也具有这样的特点，说明P蛋白有可能是仙台病毒的特异性抗原。六个蛋白中，同源性最高的是L蛋白，为96.0％～98.0％，其次是M蛋白，为93.1％～97.1％，说明二者较保守。氨基酸序列进化树分析显示，六种结构蛋白的进化树与基因组序列的进化树基本一致，仅有细微的不同，其中变化较大的是M蛋白。在M蛋白进化树中，Tianjin株与Ohita株和Hamamatsu株代表的分支最接近，同源性也最高，为97.1％，与BB1株同源性为96.6％。而在其他蛋白进化树中，Tianjin株均与BB1株亲缘关系最接近，同源性也最高。基因组末端序列分析表明，Tianjin株3’和5’末端分别含有55 nt和57 nt的前导区，且高度保守，与已知仙台病毒同源性分别为89.1％～98.2％和93.0％～96.5％。而且3’端最前12个核苷酸和5’端最后12个核苷酸互补配对，这些特点均与病毒复制和转录调控功能密切相关。除此以外，我们还分析了Tianjin株基因组序列中核苷酸变异位点的分布，以及预测的结构蛋白中氨基酸变异位点的意义。Tianjin株基因组全序列中共存在444个独特的和546个与BB1株共有的核苷酸变异位点，其中嘌呤-嘧啶之间的颠换突变分别占9.7％(43／444)和10.1％(55／546)。这些变异位点主要位于各个结构蛋白编码区，从而导致Tianjin株结构蛋白中存在着大量独特的氨基酸变异位点。这些变异位点的存在提示Tianjin株有可能在生物学特性、致病性、免疫原性、流行病学等方面与其他仙台病毒株具有很大的区别。关于这些变异位点与病毒生物学特性乃至致病性之间的关系，还有待将来采用反向遗传学技术构建重组病毒来证实。综上所述，本研究完成了副粘病毒Tianjin株基因组全长的序列测定，并且得到了可以长期保存的覆盖病毒基因组全长的cDNA分段克隆，这些克隆为病毒基因功能研究提供了材料，同时也为构建副粘病毒Tianjin株基因组全长cDNA克隆奠定了基础。另外，我们通过生物信息学方法对Tianjin株的分类地位、与已知仙台病毒的关系、以及各结构蛋白中变异位点的意义进行了探讨，希望为以后进一步深入研究该病毒的具体致病机制奠定一定的基础。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
英文缩略语  13-16
前言  16-24
第一部分副粘病毒Tianjin株全基因组分段克隆及序列测定  24-59
  材料与方法  24-44
  结果  44-53
    1.副粘病毒Tianjin株全基因组cDNA测序方案  44-45
    2.副粘病毒Tianjin株基因组cDNA片断的扩增  45-46
    3.副粘病毒Tianjin株基因组cDNA片断的克隆及序列测定  46-48
    4.副粘病毒Tianjin株基因组测序结果的验证与拼接  48-49
    5.副粘病毒Tianjin株基因组结构特征  49-53
  讨论  53-58
  小结  58-59
第二部分副粘病毒Tianjin株基因组及其编码结构蛋白的生物信息学分析  59-110
  材料与方法  60-64
  结果  64-95
    1.副粘病毒Tianjin株全基因组序列的生物信息学分析  64-69
    2.副粘病毒Tianjin株结构蛋白的生物信息学分析  69-92
    3.副粘病毒Tianjin株基因组末端序列的比较分析  92-95
  讨论  95-109
    1.副粘病毒Tianjin株分类地位确定及与已知仙台病毒亲缘关系分析  95-96
    2.副粘病毒Tianjin株基因组序列中核苷酸变异分析  96-97
    3.结构蛋白氨基酸序列中关键变异点的分析  97-105
    4.结构蛋白的系统进化及同源性比较  105
    5.基因组3’和5’末端分析  105-109
  小结  109-110
结论  110-111
综述  111-120
参考文献  120-137
在学期间发表论文  137-138
附录1  138-146
致谢  146

副粘病毒Tianjin株全基因组测序及生物信息学分析

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