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16S rRNA基因分子技术研究仔猪胃肠道菌群区系变化

作　者: 苏勇
导　师: 朱伟云
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 16S rRNA基因 仔猪 胃肠道菌群 乳酸杆菌
分类号: S852.6
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 1035次
引　用: 8次
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内容摘要


哺乳动物的胃肠道中栖息着大量的微生物,这些微生物在营养、免疫、抗感染等方面对宿主的健康发挥重要作用.仔猪因为要经历早期断奶这样一个特殊的生理阶段,因此,胃肠道微生物对其肠道的健康更显重要.本论文利用基于16S rRNA基因的分子技术研究了仔猪哺乳阶段至断奶后两周（35日龄）的胃肠道菌群区系变化.利用变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）指纹图谱及序列分析技术研究了断奶前、后仔猪胃、空肠和回肠的菌群变化,real-time PCR技术分析了其中一些优势菌群的数量变化;同时,对仔猪小肠食糜与肠壁中的细菌及乳酸杆菌菌群也进行了比较;采用代表性差异分析（Representational difference analysis,RDA）技术还比较了两株来自不同地区仔猪肠道的优势乳酸杆菌——Lactobacillus sobrius菌株;此外,还利用分子技术研究了口服L.sobrius S1后仔猪后肠菌群的变化;最后,基于不同可变区片段对不同乳酸杆菌的16S rRNA基因进行了序列比对分析,以解释一些分子技术的缺陷.1仔猪哺乳期和断奶后胃中总细菌和乳酸杆菌变化利用基于16S rRNA基因的PCR/DGGE技术研究了新生仔猪从7日龄至35日龄（断奶后两周）胃中细菌及乳酸杆菌的菌群变化.结果表明,哺乳阶段,仔猪胃食糜维持较低的pH值,断奶后,pH值显著上升;Dilution-PCR半定量分析发现,断奶前,仔猪胃中细菌数量很低,而断奶后,总细菌数量显著上升,乳酸杆菌数量则略有上升;DGGE图谱显示,断奶前胃中细菌条带较单一,优势菌为高迁移条带相关细菌,断奶后图谱中出现一些新的优势条带,而断奶前的优势条带消失;乳酸杆菌DGGE图谱相似性分析显示,断奶前、后仔猪胃中乳酸杆菌菌群变化较小.2断奶前、后仔猪胃和前肠菌群的变化本章研究了仔猪从哺乳至断奶后胃、空肠和回肠中菌群的变化.DGGE图谱分析显示,断奶前仔猪前肠图谱中的一些优势条带在断奶后消失,16S rRNA基因序列分析表明与这些条带相对应的细菌分别为L.reuteri,L.johnsonii和L.sobrius;此时,一些新的优势条带出现,序列分析对其鉴定表明,它们主要为Peptostreptococcusanaerobius,Moraxella cuniculi,Streptococcus suis和Porphyromonas catoniae.Real-timePCR定量分析表明,仔猪断奶后,前肠中乳酸杆菌和L.sobrius（断奶前的优势菌）在总细菌中的比例显著下降.同时,建立了S.suis特异性real-time PCR,它能够对猪肠道复杂菌群中的S.suis进行精确定量,最低检测浓度为每微升核酸样品10个16SrRNA基因拷贝数.该分析结果显示,断奶后3天仔猪胃中的S.suis数量达107数量级,而在哺乳阶段则未能检测到.3仔猪空、回肠食糜与肠壁中细菌及乳酸杆菌菌群比较利用16S rRNA基因分子方法比较了7日龄至35日龄仔猪空、回肠食糜与肠壁中细菌及乳酸杆菌菌群差异.DGGE分析显示,哺乳阶段仔猪空肠食糜的优势菌L.sobrius也在肠壁菌群中出现,而断奶后,空肠食糜中新出现的优势菌S.suis未在肠壁菌群中出现.这一结果在real-timePCR定量分析中也得到证实,所有肠壁样品均为检测到S.suis.比较食糜和肠壁乳酸杆菌菌群DGGE图谱发现,一些特殊条带只在肠壁样品中存在.然而,序列分析显示与这些条带最相近的细菌为alfa-proteobacteria（Brevundimonas vesicularis）.对乳酸杆菌特异引物（Lab-0159）与特殊条带相关的细菌的相应序列进行比对发现,它们之间仅有1-2个碱基的错配.4代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源L.sobrius菌株代表性差异分析技术近来被引入用于比较高相似性菌株之间的基因组差异,该技术能够在菌株水平对两株细菌基因组进行差异分析.利用DGGE和序列分析技术研究发现来自不同地区的猪源Lactobacillus sp.S1和Lactobacillus sobrius 001T菌株的16SrRNA基因全序列有很高相似性,大于99%.L.sobrius特异性引物也可以对这两株菌的16S rRNA基因的特定片段进行PCR扩增.代表性差异分析显示,这两株菌的基因组之间未有差异.以上结果说明,Lactobacillus sp.S1菌株也属于L.sobrius,并且推测这两株菌为同一菌株.5益生菌L.sobrius S1对仔猪后肠菌群的影响结合PCR-DGGE、16S rRNA基因序列分析及定量real-time PCR技术,研究口服益生菌L.sobrius S1菌株后仔猪从7至35日龄（断奶后两周）后肠菌群的变化.六窝新生仔猪被随机分成两组:对照组和处理组,处理组仔猪于7、9和11日龄口服S1菌液(活菌数5×109 CFU·ml-1).分别于7、14、21、24和35日龄,每窝随机屠宰一头仔猪,收集肠道样品.比较不同日龄仔猪后肠菌群DGGE图谱表明,断奶后图谱中多数高迁移距离条带消失,至断奶后两周又逐渐出现.序列分析显示,这些高迁移距离条带主要为乳酸杆菌.平板计数以及定量real-time PCR分析也得到一致的结果.乳酸杆菌特异性PCR-DGGE分析显示,仔猪断奶后,L.amylovorus和L.sobrius从优势乳酸杆菌菌群中消失.通过比较处理组和对照组图谱发现,处理组在14日龄出现一特异条带,与其匹配的序列的最相似已知菌为Clostridium disporicum,相似性为95%;而35日龄时对照组有一特异优势条带,该条带被鉴定为猪链球菌,相似性为99%.L.sobrius特异性real-time PCR分析显示,断奶后3天该菌从仔猪结肠中消失,而处理组仔猪有更早出现该菌的趋势.6基于不同可变区片段比较乳酸杆菌间16S rRNA基因序列差异基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技术已广泛用于各种环境中菌群生态的研究.近来,一些研究者发现该技术存在一些缺陷,如图谱中的单一条带常常被鉴定为几种细菌,而不同条带会被鉴定为同一种细菌.本研究中,以不同乳酸杆菌为例,分别在三个不同可变区片段比较了不同种乳酸杆菌的16S rRNA基因差异.结果表明,属于不同种的乳酸杆菌之间有相同的16S rRNA基因片段序列;不同可变区片段间,乳酸杆菌16S rRNA基因序列的俩俩间的同源性也有很大差异.两个Lactobacillusamylovorus相关克隆虽然有相同的V2-V3可变区,但是它们V6-V8可变区序列的距离为0.061.这些结果说明,DGGE的这一缺陷很大程度上是由细菌16S rRNA基因序列的自身特性所引起的;结果同时也提示,在设计用于DGGE的PCR引物时,除了考虑引物的特异性外,还应该注意所扩增出的不同细菌的产物序列之间的差异程度.

全文目录


中文摘要  7-10
英文摘要  10-15
缩略符号  15-16
引言  16-17
第一篇 文献综述  17-37
  1 仔猪胃肠道菌群发育  17-20
  2 肠道微生物区系的主要功能  20-24
    2.1 对肠道发育的影响  20
    2.2 发挥肠道屏障作用  20-21
    2.3 对免疫反应的影响  21-22
    2.4 微生物在宿主消化和吸收营养物上的作用  22-24
      2.4.1 对碳水化合物的利用  22
      2.4.2 对蛋白物质的利用  22-23
      2.4.3 对脂类物质的利用  23-24
  3 通过日粮调控肠道菌群  24-29
    3.1 日粮纤维  24
    3.2 益生素  24-26
    3.3 化学益生素  26-27
    3.4 酸化剂对仔猪胃肠道健康的影响  27
    3.5 其它活性物质对消化道微生物区系的影响  27-29
  4 分子生物学技术研究胃肠道微生物区系  29-35
    4.1 16S rRNA基因克隆文库  29-30
    4.2 16S rRNA基因指纹技术  30-31
    4.3 16S rRNA基因定量技术  31-33
      4.3.1 Real-time PCR  32-33
      4.3.2 荧光原位杂交技术  33
    4.4 基因芯片技术  33-34
    4.5 肠道微生态研究从结构到功能的转变  34-35
  5 本研究的目的和意义  35-37
    5.1 仔猪胃肠道菌群研究存在的问题  35
    5.2 本研究的目的和意义  35-36
    5.3 主要内容和技术路线  36-37
第二篇 实验研究  37-98
  第一章 PCR-DGGE分析仔猪哺乳期和断奶后胃中总细菌和乳酸杆菌变化  37-44
    1 材料和方法  37-39
    2 结果与分析  39-41
    3 讨论  41-43
    英文摘要  43-44
  第二章 断奶前、后仔猪胃和前肠菌群的变化  44-56
    1 材料和方法  45-47
    2 结果与分析  47-53
    3 讨论  53-55
    英文摘要  55-56
  第三章 仔猪空、回肠食糜与肠壁中细菌及乳酸杆菌菌群比较  56-67
    1 材料和方法  56-59
    2 结果与分析  59-64
    3 讨论  64-66
    英文摘要  66-67
  第四章 代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源Lactobacillus sobrius菌株  67-75
    1 材料和方法  68-70
    2 结果与分析  70-72
    3 讨论  72-74
    英文摘要  74-75
  第五章 16S rRNA基因分子技术研究益生菌Lactobacillus sobrius S1对仔猪后肠菌群的影响  75-88
    1 材料和方法  76-79
    2 结果与分析  79-85
    3 讨论  85-87
    英文摘要  87-88
  第六章 基于不同可变区片段比较乳酸杆菌间16S rRNA基因序列差异  88-98
    1 材料和方法  89-90
    2 结果与分析  90-95
    3 讨论  95-97
    英文摘要  97-98
全文结论  98-99
参考文献  99-114
全文创新  114-115
附录  115-134
  附录Ⅰ  115-117
  附录Ⅱ  117-134
攻读博士学位期间发表的论文  134-135
致谢  135

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学）
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