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昆虫细胞的建库技术研究及昆虫细胞的原代培养

作　者: 宋德伟
导　师: 陈晓鸣；冯颖
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 森林保护
关键词: 昆虫细胞细胞库细胞系原代细胞培养
分类号: Q962
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 312次
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内容摘要

本研究是针对目前我国只有 20 余株昆虫细胞系的状况，通过自建和收集国内外的昆虫细胞系，建立我国的第一个专业昆虫细胞库，为我国的生物技术、分子生物学、生化和遗传研究提供必要的技术和物质储备。本研究利用多种昆虫的不同组织进行了昆虫细胞体外培养的尝试，为建立新的昆虫细胞系提供了必要的理论基础和有益的借鉴。并对昆虫细胞建库技术作了初步的研究，从而为昆虫细胞研究提供了重要的理论依据。 1、细胞建库技术的初步研究对本实验室从日本引进的 7 株细胞系进行细胞形态学的统计观察，测定细胞生长曲线，计算其倍增时间得出：· 细胞系 FRI—SPIM—l 229 来源于桑斑血灯蛾(Silosoma imparilis Butler)5 龄幼虫脂肪体，细胞倍增时间为 87．8 小时；· 细胞系 Grace’s A．e cell 来源于伊蚊(Aedes albopictus Skuse)，细胞倍增时间为 62．6 小时；● 细胞系 NIAS—MaBr 一 85 来源于甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae Lirmaeus)5 龄幼虫脂肪体，细胞倍增时间为 50．23 小时：· 细胞系 NIAS—Px 一 58 来源于柑橘凤蝶(Papilio．xuthus LInnaeus)蛹卵巢，细胞倍增时间为 63．5 小时；·细胞系 NIH—SaPe 一 4 来源于双翅目昆虫麻蝇(Sarcophaga peregrina)成虫卵巢内发育成胚，细胞倍增时间为 92．9 小时；· 细胞系 SES—MaBr-2 来源于甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae Linnaeus)龄幼虫脂肪体，细胞倍增时间为 135 个小时；●NIAS—MaBr－92 来源于甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae Linnaeus)5 龄幼虫血球，细胞倍增时间为 45．7 小时。本实验除了测定所保存的 7 株细胞系的生长特性和形态特征外，还采用对比方法，即分别选用超低温冰箱和液氮罐并选用二甲亚砜和甘油为保护剂，冻存了 7株引进细胞系。实验中分别对七株细胞进行了冷冻保存和复苏的实验对比，探讨总结了昆虫细胞建库中保存细胞需要注意的一些问题，为建立细胞系库充实了必要的参考数据，并且为昆虫细胞系库的建立技术研究奠定了一定的基础。 2．昆虫细胞的原代培养 (1)思茅松毛虫（Dendrolimus kikuchii Matsumura)虫卵和幼虫组织细胞的原代培养在国内外首次利用云南松毛虫虫卵和幼虫组织进行体外培养。细胞移入培养’瓶的第三天可以观察到有细胞从组织块中迁移出来，呈梭形且贴壁，第十天以后<WP=6>细胞生长出现停顿，细胞持续了 55 天后死亡。(2)云南琵琶甲(Blaps japanesis yunnanensis Mars)血淋巴细胞的原代培养国内首次体外培养鞘翅目昆虫细胞。本研究利用云南药用昆虫“云南琵琶甲”成虫的血淋巴细胞，进行体外培养。在细胞移入培养瓶的第三天有部分细胞贴壁，第四天可看到有新的细胞从组织块中迁移出来，第十五天大多数细胞已发生皱缩，第十七天细胞全部死亡。(3)白带锯蛱蝶(Cethosia cyane Drury)蛹脂肪体细胞的原代培养在国内外首次利用白带锯蛱蝶蛹脂肪体细胞进行体外培养。大约 7 天形成了少数贴壁的细胞聚集团，在培养的初期有细胞从组织块中迁移出来，细胞到目前已存活了 7 个月。本研究通过对不同虫种、不同组织的细胞进行体外原代培养的尝试，在一些虫种上取得了较好的进展，总结了在昆虫细胞原代培养过程中关于虫体组织的选取和处理以及细胞传代过程中需要注意的一些问题，为下一步新昆虫细胞系的建立提供了有益的经验借鉴。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
1 引言  13-14
2 昆虫细胞培养研究综述  14-20
  2.1 昆虫细胞培养基的研究  14-15
  2.2 昆虫细胞系的建立  15-16
  2.3 昆虫细胞培养过程中微生物的污染  16-17
    2.3.1 污染的检测  16-17
    2.3.2 污染的排除  17
  2.4 昆虫细胞的冻存与复苏  17-18
    2.4.1 冷冻保存方法  18
    2.4.2 冻存昆虫细胞的复苏  18
  2.5 昆虫细胞-杆状病毒表达系统(ＢＥＶＳ)  18-20
    2.5.1 ＢＥＶＳ的特点  19
    2.5.2 昆虫细胞的大规模培养  19-20
3 昆虫细胞建库技术的初步研究  20-67
  3.1 材料  20
  3.2 建立昆虫细胞库所需的设备和器具  20-22
    3.2.1 培养基配制所需的设备和器具  20-21
    3.2.2 体外培养的设备和器具  21
    3.2.3 玻璃器皿的清洗与消毒  21-22
  3.3 方法  22-28
    3.3.1 MM 培养基的制备  22
    3.3.2 MGM-450 培养基的制备  22-25
    3.3.3 细胞生长特征的研究方法  25-26
      3.3.3.1 细胞生长曲线的绘制  25
      3.3.3.2 倍增时间的计算  25-26
    3.3.4 细胞形态特征的研究方法  26-27
      3.3.4.1 细胞大小的测定  26-27
      3.3.4.2 细胞形态的分类统计  27
    3.3.5 细胞的冻存与复苏  27-28
      3.3.5.1 细胞的冻存方法  27
      3.3.5.2 细胞解冻复苏的方法  27-28
  3.4 结果与讨论  28-66
    3.4.1 实验结果  28-64
      3.4.1.1 细胞系的生长特性与形态特征  28-62
        (1) 细胞系ＦＲＩ－ＳＰＩＭ－  28-33
          1 )细胞生长特性  28-30
          2 )细胞形态特征  30-33
        (2) 细胞系Ｇｒａｃｅ’Ａ.ｅＣｅｌｌ  33-38
          1 )细胞生长特性  33-36
          2 )细胞形态特征  36-38
        (3) 细胞系ＮＩＡＳ－ＭａＢｒ－  38-43
          1 )细胞生长特性  38-40
          2 )细胞形态特征  40-43
        (4) 细胞系ＮＩＡＳ－Ｐｘ－  43-48
          1 )细胞生长特性  43-45
          2 )细胞形态特征  45-48
        (5) 细胞系ＮＩＨ－ＳａＰｅ－  48-53
          1 )细胞生长特性  48-50
          2 )细胞形态特征  50-53
        (6) 细胞系ＳＥＳ－ＭａＢｒ－  53-57
          1 )细胞生长特性  53-55
          2 )细胞形态特征  55-57
        (7) ＮＩＡＳ－ＭａＢｒ－  57-62
          1 )细胞生长特性  57-59
          2 )细胞形态特征  59-62
      3.4.1.2 细胞冻存结果  62-64
    3.4.2 讨论  64-66
      3.4.2.1 关于细胞生长曲线绘制的讨论  64
      3.4.2.2 关于细胞生长特征的讨论  64-65
      3.4.2.3 关于细胞冻存的讨论  65
      3.4.2.4 关于细胞复苏的讨论  65-66
  3.5 小结  66-67
4 昆虫细胞的原代培养  67-78
  4.1 思茅松毛虫细胞的原代培养  67-72
    4.1.1 材料  67
    4.1.2 方法  67-71
      4.1.2.1 Ｇｒａｃｅ培养基的配制  67-70
      4.1.2.2 原代细胞的培养  70-71
    4.1.3 结果与讨论  71-72
  4.2 云南琵琶甲血淋巴细胞的原代培养  72-74
    4.2.1 材料  72
    4.2.2 方法  72-73
    4.2.3 结果与讨论  73-74
  4.3 白带锯蛱蝶蛹脂肪体细胞的原代培养  74-76
    4.3.1 材料  74
    4.3.2 方法  74-75
    4.3.3 结果与讨论  75-76
  4.4 小结  76-78
    4.4.1 关于虫体组织处理的建议  76
    4.4.2 关于细胞传代的建议  76-78
参考文献  78-81
致谢  81-82
附录  82

昆虫细胞的建库技术研究及昆虫细胞的原代培养

内容摘要

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