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泄浊除痹方总黄酮治疗高尿酸血症机制研究

作　者: 臧路平
导　师: 吴新荣
学　校: 华南理工大学
专　业: 制糖工程
关键词: 高尿酸血症泄浊除痹方总黄酮小鼠肾脏特异性转运蛋白黄嘌呤氧化酶
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

高尿酸血症(hyperuricemia)是指血液中的尿酸浓度超出正常范围的一种机体状态。近年来,随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变,高尿酸血症患病率有非常明显的上升趋势。高尿酸血症作为一种代谢性疾病,与心血管疾病,慢性肾脏病及代谢综合症(糖尿病,胰岛素抵抗和肥胖)密切相关。产生血清尿酸浓度高于正常水平的主要原因为两方面：一为尿酸生成过多,另一方面是尿酸排泄减少。肝脏中的黄嘌呤氧化酶是催化尿酸生成的主要氧化酶,该酶作用受到抑制后,尿酸生产量将会减少；负责尿酸转运的是固定在肾小管上皮细胞上的各种转运蛋白,其中,固定在肾脏近端小管上皮细胞刷状缘侧的尿酸阴离子转运蛋白1(URAT1, urate-anion transporter 1)作为负责尿酸重吸收的主要蛋白,是治疗高尿酸血症的主要靶点之一。小鼠肾脏特异性转运蛋白(Mouse Renal-specific transporter, RST)作为URAT1的鼠源同系物,为以URAT1为靶点的高尿酸血症治疗药物研究,提供了取材方便的体内外实验模型来源。目前,由于西药存在一定的副作用,中药治疗的安全性及长期适用性使其成为治疗高尿酸血症的趋势。泄浊除痹方作为一种中药处方,在临床上已经取得一定成果。本课题组之前对其有效部位总黄酮进行了分离。在此基础上,具体研究内容如下：小鼠肾脏近端小管上皮细胞原代培养条件优化及功能测试：采用机械破碎与酶消化结合法,优化小鼠肾脏近端小管上皮细胞原代培养条件,经鉴定后,对细胞尿酸吸收功能进行验证,结果如下：经机械破碎的肾脏皮质组织在400U胶原酶Ⅰ处理20min时,肾小管节段贴壁率达到最高为54.5%；首次换液最佳时间为72h；细胞在原代培养第5天生长达到对数期,在第10天状态开始有所下降,折光率低,出现部分漂浮死亡细胞。在1500μM尿酸浓度的吸收培养基中,吸收实验进行30mmin时,其对尿酸吸收速率达到最大。指示药物丙磺舒和苯溴马隆在不同的浓度下,对尿酸吸收的抑制率不同,其中苯溴马隆的抑制率要高于丙磺舒。泄浊除痹方总黄酮对小鼠肾小管上皮细胞增殖及尿酸吸收的影响：将原代培养的小鼠肾脏近端小管上皮细胞用不同浓度泄浊除痹方总黄酮孵育48h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性。配制尿酸吸收培养基,进行尿酸吸收实验,采用尿酸检测试剂盒测定尿酸吸收值。结果显示：高浓度组总黄酮(10、7.5、5g·L-1)对细胞生长有不同程度的抑制作用,低浓度组药物(2.5、0.5g·L-1)对细胞生长活性无显著影响；在对细胞生长活性无显著影响的低浓度梯度范围内(2.5、2、1.5、1.0、0.5g·L-1),药物对尿酸吸收表现出不同程度的抑制作用。该研究表明泄浊除痹方总黄酮对小鼠肾小管上皮细胞尿酸吸收功能有一定的抑制作用。泄浊除痹方总黄酮对RST基因表达的影响：利用分子实验手段检测不同药物作用浓度下,细胞中RST蛋白的基因表达。结果显示：泄浊除痹方总黄酮在1g·L-1～2.5g·L-1浓度范围内对尿酸吸收有显著抑制；在1g·L～2.5g·L-1范围内,RST表达明显下调。该研究表明泄浊除痹方能够通过下调RST基因表达降低RTECs尿酸吸收作用。泄浊除痹方总黄酮对肝脏黄嘌呤氧化酶的体外抑制作用：本课题通过以上实验证明了泄浊除痹方总黄酮在体外对尿酸吸收具有抑制作用,并以RST为靶点研究了该抑制作用的分子机制,同时,该成分对黄嘌呤氧化酶的氧化活性有一定的抑制作用。这些都证明泄浊除痹方对高尿酸血症具有一定的治疗效果。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章绪论  13-30
  1.1 高尿酸血症与相关疾病  13-15
    1.1.1 高尿酸血症与心血管疾病  13-14
    1.1.2 高尿酸血症与慢性肾脏病  14-15
    1.1.3 高尿酸血症与代谢综合征  15
  1.2 高尿酸血症发病机制  15-17
    1.2.1 原发性高尿酸血症发病机制  15-16
    1.2.2 继发性高尿酸血症发病机制  16-17
  1.3 高尿酸血症治疗药物及其作用靶点  17-21
    1.3.1 黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)  17
    1.3.2 尿酸盐阴离子转运体1(URAT1)  17-19
    1.3.3 果糖转运子9(GLUT 9)  19-20
    1.3.4 三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(ABCG2)  20
    1.3.5 其他靶点  20-21
  1.4 高尿酸血症治疗药物研究现状  21-22
  1.5 基于治疗高尿酸血症药物作用靶点的机制研究方法  22-27
    1.5.1 以XOD为靶点的治疗机制研究方法  22-23
    1.5.2 以尿酸转运蛋白为靶点的机制研究方法  23-25
    1.5.3 爪蟾卵母细胞表达体系(Xenopus oocyte expression system)  25
    1.5.4 体外细胞模型  25-26
    1.5.5 整体动物模型  26-27
  1.6 本课题的研究内容及意义  27-30
    1.6.1 研究内容  27-28
    1.6.2 研究意义  28-30
第二章小鼠肾脏近端小管上皮细胞原代培养条件优化及功能测试  30-44
  2.1 实验仪器、材料及试剂  30-31
    2.1.1 仪器  30-31
    2.1.2 实验动物及材料  31
  2.2 实验方法  31-37
    2.2.1 溶液配制  31-33
    2.2.2 肾组织处理  33
    2.2.3 肾小管节段分离  33-34
    2.2.4 首次换液时间对肾小管节段贴壁率的影响  34
    2.2.5 Ⅰ型胶原酶消化条件对肾小管贴壁率的影响  34
    2.2.6 细胞生长曲线绘制  34-35
    2.2.7 细胞鉴定  35
    2.2.8 尿酸吸收功能测试  35-37
    2.2.9 阳性药物对尿酸吸收的抑制作用  37
  2.3 结果与讨论  37-43
    2.3.1 首次换液时间对肾小管节段贴壁率的影响  37-38
    2.3.2 Ⅰ型胶原酶消化条件对肾小管贴壁率的影响  38-39
    2.3.3 细胞生长曲线的绘制  39
    2.3.4 细胞鉴定  39-41
    2.3.5 细胞尿酸吸收功能测试  41-42
    2.3.6 讨论  42-43
  2.4 本章小结  43-44
第三章泄浊除痹方总黄酮对小鼠RTECs增殖及尿酸吸收的影响  44-51
  3.1 主要实验材料与仪器  44-45
    3.1.1 实验材料  44
    3.1.2 实验试剂  44-45
  3.2 实验方法  45-50
    3.2.1 RTECs细胞的培养  45-46
    3.2.2 泄浊除痹方总黄酮溶液配制  46
    3.2.3 泄浊除痹方总黄酮对RETCs增殖活性的影响  46-47
    3.2.4 不同浓度泄浊除痹方总黄酮对尿酸吸收的体外抑制作用  47-48
    3.2.5 实验结果  48-50
  3.4 本章小结  50-51
第四章泄浊除痹方总黄酮体外抑制尿酸吸收分子机制研究  51-58
  4.1 主要实验材料和仪器  51-52
    4.1.1 实验材料  51
    4.1.2 实验试剂  51-52
    4.1.3 实验仪器  52
  4.2 实验方法  52-56
    4.2.1 细胞预处理  52-53
    4.2.2 RNA的提取  53-54
    4.2.3 RST蛋白基因扩增引物设计  54
    4.2.4 反转录与cDNA扩增  54-56
  4.3 实验结果和讨论  56-57
    4.3.1 泄浊除痹方总黄酮对RST基因表达的影响  56
    4.3.2 讨论  56-57
  4.4 本章小结  57-58
第五章泄浊除痹方总黄酮体外抑制黄嘌呤氧化酶活性研究  58-65
  5.1 实验材料与仪器  58
    5.1.1 实验材料  58
    5.1.2 实验试剂与仪器  58
  5.2 实验方法  58-60
    5.2.1 试剂的配制  58-59
    5.2.2 酶活测定原理  59
    5.2.3 酶促反应米氏方程的绘制  59
    5.2.4 黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制实验  59-60
  5.3 实验结果与讨论  60-64
    5.3.1 实验结果  60-64
    5.3.2 讨论  64
  5.4 小结  64-65
总结与展望  65-67
  1 结论  65
  2 创新点  65
  3 展望  65-67
参考文献  67-73
攻读硕士学位期间取得的研究成果  73-74
致谢  74-75
附件  75

泄浊除痹方总黄酮治疗高尿酸血症机制研究

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