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猪孤雌四倍体胚胎的制备及体外培养

作　者: 吴苏君
导　师: 雷安民
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 孤雌胚胎四倍体制备四倍体补偿技术猪
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

四倍体细胞在胚胎组织发育过程中会出现严重偏离分布现象,因为在个体发育过程中,其仅能参与胚外组织的形成。将一定数量的ES细胞或iPS细胞与四倍体胚胎嵌合,在嵌合胚胎发育过程中,其胚外组织主要来源于四倍体细胞,而胚体完全由ES细胞或iPS细胞来源的细胞构成,这种技术被称为四倍体胚胎补偿技术。2009年我国科学家周琪等获得iPS四倍体补偿小鼠,在世界上首次证明了iPS细胞具有与ES细胞一样的多潜能性,为iPS技术的应用提供了坚实的理论基础。2009年我国在世界上率先获得了猪的iPS细胞。在理论上,利用猪iPS细胞通过四倍体补偿技术可以获得完全由iPS细胞发育而来的克隆猪。故此本研究对猪孤雌四倍体胚胎的制备方法进行了摸索,并将其在体外培养的条件进行了优化,最后对获得的孤雌四倍体胚胎的质量进行了检测,取得如下结果:1、在猪卵母细胞成熟培养20~22 h后,不添加激素的成熟液比添加激素的成熟液获得了更高的成熟率(68.8% & 60.7%),但无统计学差异(P>0.05);2、在PZM-3胚胎培养液中添加3 mg/mL BSA能提高孤雌激活的胚胎卵裂率和囊胚率(67.8%; 31.3%);3、在PZM-3胚胎培养液中添加10%血清组囊胚率和孵化囊胚率略好于不添加组(27.3% & 22.9%; 0.05% & 0.03%),但无统计学差异(P>0.05)。利用Hoechst 33342对添加血清组和不添加组囊胚细胞进行染色计数,结果显示,添加血清组的囊胚细胞核小、细胞数多,不添加血清组囊胚细胞核大、细胞数少;4、筛选猪孤雌激活2-细胞胚的电融合参数,结果显示:375/25×2(即电场强度为375 V/mm、脉冲时程为25μs的两次电脉冲)的电融合参数组合可以获得相对较好的融合率(92%)和卵裂率(62%);5、利用Real-time PCR和免疫荧光染色法检测猪孤雌四倍体囊胚中多能性因子的表达,结果显示猪孤雌四倍体囊胚中表达多能性基因nanog、oct4、sox2的mRNA,其表达量比孤雌囊胚低,但差异不显著,免疫荧光检测蛋白表达定位,发现这三个基因均表达并定位于囊胚细胞的细胞核;6、用显微注射法将猪iPS细胞分别注入2-细胞期、4-细胞期、6-细胞期、8-细胞期和桑椹胚期孤雌四倍体胚胎的卵周隙内,以及直接注射到孤雌四倍体囊胚腔中,在体外培养过程中均未确认嵌合现象。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
文献综述  12-30
  第一章四倍体补偿技术研究进展  12-23
    1.1 四倍体补偿技术简介  12-15
      1.1.1 四倍体补偿技术简介  12-13
      1.1.2 四倍体胚胎与ES 细胞嵌合胚制备方法  13-14
      1.1.3 影响胚胎嵌合效率的因素  14-15
    1.2 哺乳动物四倍体补偿技术研究进展  15-19
      1.2.1 小鼠四倍体补偿技术相关研究  15-16
      1.2.2 猪四倍体补偿技术相关研究  16-18
      1.2.3 牛四倍体补偿技术相关研究  18
      1.2.4 iPS 研究现状  18
      1.2.5 体细胞核移植克隆技术与四倍体嵌合技术比较  18-19
    1.3 四倍体胚胎制备方法相关研究  19-23
      1.3.1 四倍体胚胎制备方法应用研究  19-21
      1.3.2 电融合方法的相关研究  21-23
  第二章孤雌四倍体胚胎体外培养  23-28
    2.1 成熟液中不同添加物对猪卵母细胞体外成熟的影响  23-25
      2.1.1 EGF 对猪卵母细胞体外发育的影响  23-24
      2.1.2 ITS 对猪卵母细胞体外发育的影响  24
      2.1.3 FSH 对猪卵母细胞体外发育的影响  24
      2.1.4 PMSG、hCG 联合作用对猪卵母细胞体外发育的影响  24-25
    2.2 激活方式对猪孤雌胚胎发育的影响  25
    2.3 胚胎培养液对体外发育胚胎的影响  25-26
    2.4 体外培养的其他影响因素  26-28
  第三章四倍体胚胎发育潜能研究  28-30
    3.1 四倍体胚胎鉴定  28
    3.2 多能性基因的表达  28-30
试验研究  30-53
  第四章猪孤雌四倍体胚胎制备及体外培养  30-41
    4.1 材料和方法  30-33
      4.1.1 仪器设备和主要试剂  30-31
        4.1.1.1 仪器设备  30
        4.1.1.2 主要试剂  30-31
        4.1.1.3 试验耗材  31
        4.1.1.4 数据分析  31
      4.1.2 实验方法  31-33
        4.1.2.1 猪卵母细胞的收集  31
        4.1.2.2 优化猪卵母细胞成熟体系  31-32
        4.1.2.3 卵母细胞核成熟的观察及电激活  32
        4.1.2.4 筛选制备猪四倍体胚胎的电融合参数  32
        4.1.2.5 比较同一体外培养体系中猪四倍体胚胎与孤雌胚胎发育情况  32
        4.1.2.6 优化猪胚胎培养液  32-33
    4.2 结果与分析  33-38
      4.2.1 猪卵母细胞成熟过程中更换培养液对成熟的影响  33
      4.2.2 不同电融合参数制备猪四倍体效率  33-34
      4.2.3 同一体外培养体系对猪四倍体胚胎与孤雌胚胎发育的影响  34
      4.2.4 不同猪胚胎培养液对胚胎发育的影响  34-36
      4.2.5 观察猪四倍体胚胎制备过程  36-38
    4.3 讨论  38-40
      4.3.1 猪卵母细胞成熟过程的影响因素  38-39
      4.3.2 关于电融合参数的选择  39
      4.3.3 关于孤雌激活后胚胎培养的影响因素  39-40
    4.4 小结  40-41
  第五章猪孤雌四倍体胚胎质量检测  41-53
    5.1 材料和方法  41-45
      5.1.1 仪器设备和主要试剂  41
      5.1.2 实验方法  41-45
    5.2 结果与分析  45-50
      5.2.1 观察猪四倍体胚胎染色体数量  45-46
      5.2.2 猪孤雌四倍体囊胚和孤雌囊胚形态  46-47
      5.2.3 猪孤雌四倍体囊胚多能性检测结果  47-50
    5.3 讨论  50-52
      5.3.1 猪四倍体染色体数量  50-51
      5.3.2 猪孤雌四倍体囊胚形态学评估  51
      5.3.3 猪孤雌四倍体囊胚多潜能性表现  51
      5.3.4 不同发育时期的猪四倍体胚胎与iPS 细胞嵌合  51-52
    5.4 小结  52-53
结论  53
本研究的创新点与进一步研究的课题  53-54
参考文献  54-63
缩略词  63-65
致谢  65-66
作者简介  66

猪孤雌四倍体胚胎的制备及体外培养

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