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羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

作　者: 李继连
导　师: 李刚；张富梅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: 羊附红细胞体体外驱虫特异性抗原切胶纯化双抗体夹心ELISA
分类号: S855.99
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

羊附红细胞体病是一种人畜共患病,其病原体为羊附红细胞体(E.ovis)。为了准确快速诊断该病,为及时进行有效防治提供技术支撑,本试验探索一种准确高效的羊附红细胞体特异性抗原制备技术,以此建立特异、灵敏的双抗体夹心ELISA检测方法。采集红细胞感染率>90%的羊附红细胞体阳性抗凝血,分别应用水浴法和药物体外驱虫法对羊附红细胞体进行解离,观察分离前后附红细胞体感染率(%)、红细胞感染强度(个)、附红细胞体数(1×104/mm3)、杂质含量和附红细胞体的运动性五项指标；提取附红细胞体抗原,制备全蛋白悬液,测定蛋白质含量,比较解离效果。将两种方法制备的羊附红细胞体抗原全蛋白进行SDS-PAGE试验,观察条带是否一致。结果显示,200mL血液中加入1mL双向红链灭,4℃作用36h,即可达到较好分离效果。与水浴法相比,解离后,红细胞感染率和感染强度明显下降,蛋白含量增加,收率高,纯度好。SDS-PAGE结果显示,体外驱虫法所制备的附红细胞体抗原全蛋白悬液,其抗原蛋白带与水浴法相同。应用体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原全蛋白,采用切胶技术、水平电泳技术和透析方法将其纯化后,再应用SDS-PAGE和免疫印迹试验筛选出有免疫原性的特异性抗原蛋白成分。再次纯化这些成分,并免疫家兔,制备并提纯抗体,进一步建立特异、灵敏的血清学检测方法—双抗体夹心ELISA方法。结果表明,粗制抗原主要由4条带组成,纯化后经分析分子量分别为115.35kDa,74.13 kDa,68.87 kDa,32.96 kDa。免疫印迹试验中,只分子量为115.35kDa和68.87 kDa的两条带与阳性血清反应,因此认定为羊附红细胞体特异性抗原蛋白。其余两条带或只一部分成阳性,或不反应。双抗体夹心ELISA试验结果表明,特异性免疫抗原蛋白浓度为1.8mg/mL,免疫家兔35天后,兔血清抗体效价高达1：5120；敏感性试验结果显示抗原最低检出量为3.55μg/mL,较应用粗制抗原制备抗体建立的ELISA方法敏感度提高。特异性试验结果显示,纯化抗体只与羊附红细胞体反应,而与肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌不反应；由交叉性试验结果可见,用纯化抗体检测抗原时,只有羊附红细胞体呈阳性反应,不与其他动物附红细胞体的抗原反应,说明本试验特异性好。从张家口地区某些羊场采取血样100份,应用本检测方法进行检测,结果羊附红细胞体阳性率为79%,优于镜检法(阳性率为62%),差异显著(P<0.05)。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-19
  1.1 课题提出的背景及研究意义  12-13
    1.1.1 课题提出的背景  12
    1.1.2 课题的研究意义  12-13
  1.2 国内外研究现状  13-17
    1.2.1 国内外研究现状  13-17
    1.2.2 目前存在的问题  17
  1.3 主要研究内容、方法及思路  17
    1.3.1 应用药物体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原  17
    1.3.2 羊附红细胞体特异性抗原制备  17
    1.3.3 双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用  17
  1.4 SDS-PAGE的原理及特点  17-18
  1.5 免疫印迹技术原理及特点  18-19
第二章材料、方法与程序  19-32
  2.1 材料与仪器  19-20
    2.1.1 试验动物  19
    2.1.2 主要生物学试剂  19
    2.1.3 主要化学试剂  19-20
    2.1.4 主要仪器  20
  2.2 方法与程序  20-32
    2.2.1 主要溶液的配制  20-26
    2.2.2 粗制羊附红细胞体抗原  26
    2.2.3 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE  26-28
    2.2.4 羊附红细胞体特异性抗原制备  28-30
    2.2.5 羊附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立  30-32
第三章结果  32-38
  3.1 羊附红细胞体形态学观察结果  32
  3.2 应用体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原结果  32-34
    3.2.1 附红细胞体分离前后镜检结果  32-33
    3.2.2 解离液蛋白浓度测定  33
    3.2.3 抗原全蛋白的SDS-PAGE试验  33-34
  3.3 羊附红细胞体特异性抗原制备结果  34-35
    3.3.1 兔抗羊附红细胞体阳性血清效价测定结果  34
    3.3.2 粗制抗原全蛋白的SDS-PAGE试验结果  34
    3.3.3 纯化抗原蛋白SDS-PAGE分析结果  34
    3.3.4 免疫印迹试验筛选特异性抗原蛋白结果  34-35
  3.4 羊附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立  35-38
    3.4.1 兔抗羊附红细胞体阳性血清效价测定结果  35
    3.4.2 纯化抗体含量测定结果  35
    3.4.3 羊附红细胞体双抗体夹心ELISA试验条件选择结果  35-38
第四章讨论  38-41
  4.1 羊附红细胞体显微镜检查  38
  4.2 羊附红细胞体解离技术探讨  38-39
  4.3 羊附红细胞体特异性抗原制备技术探讨  39
  4.4 双抗体夹心ELISA诊断方法的建立  39-41
第五章全文结论  41-42
  5.1 探索出一种羊附红细胞体解离新技术  41
  5.2 新建一种羊附红细胞体特异性抗原制备技术  41
  5.3 建立了羊附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法  41-42
参考文献  42-45
致谢  45-46
作者简历  46

羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

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