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H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究

作　者: 张伟
导　师: 夏咸柱；秦川；张连峰
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 禽流感病毒靶向制剂 siRNA 聚乙烯亚胺单链抗体干扰RNA PA基因
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

第一章H5N1亚型高致病性禽流感病毒 siRNA 靶向制剂的研究背景高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza, HPAI)是由H5亚型或H7亚型禽流感病毒感染所致的一种禽类的烈性传染病。由高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)引起的大流行,已造成近亿只的禽类死亡和重大的经济损失。其爆发常常是毁灭性的,危害性很大。因此,高致病性禽流感被国际兽疫局定为A类传染病。H5N1亚型高致病性禽流感病毒突破种间障碍直接感染人于1997年在中国香港被首先报道,之后其致病性和传播能力不断增高,人H5N1禽流感病例持续出现,这引起了世人的震惊和关注。目前,全世界已有58个国家和地区发现H5N1亚型禽流感病毒感染人类的病例,病死率超过60%。这种严峻的形势也说明目前的疫苗和抗流感药物(如达菲)并不能有效地控制和治疗人H5N1高致病性禽流感。鉴于H5N1高致病性禽流感对人类健康造成的巨大威胁,新的抗H5N1亚型高致病性禽流感病毒药物的开发和研制变得日趋迫切。有鉴于此,本论文开展了H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究。方法本研究利用聚乙烯亚胺(PEI)可以结合核酸和蛋白的特性,通过带有负性氨基酸尾(D4S×5)的HA单链抗体(ScFv-Tail)靶向传递siRNA：利用ScFv-Tail识别感染了病毒的宿主细胞表面的血凝素蛋白(HA),精准定位感染细胞；PEI作为一种多聚阳离子聚合物紧密结合带有负电荷的ScFv-Tail和siRNA,这样通过ScFv-Tail靶向传递siRNA进入细胞后发挥抑制病毒复制的能力。在MDCK细胞上,通过流式细胞术观察靶向制剂的转染效果,并于接毒前和接毒后加入靶向制剂观察其抑制病毒复制的能力,通过实时定量PCR检测H5N1流感病毒的NP、PA和PB1基因的相对表达量,Western blot和间接免疫荧光实验(IFA)检测病毒NP蛋白的表达情况。同时,观察靶向制剂对H5N1流感病毒在小鼠肺内复制的抑制作用和其对H5N1流感病毒攻毒小鼠的保护作用。结果流式细胞术结果显示,在接毒后的MDCK细胞(infectious cell)上,靶向制剂的转染效率高于DNA/PEI组(P<0.05)；病毒滴度测定(TCID50)结果显示,接毒前加入靶向制剂,病毒滴度略微下降,与PEI／siRNA组相比没有显著性差异(P>0.05),接毒后加入靶向制剂,病毒滴度显著下降,存在显著性差异(P<0.05)；实时定量PCR结果显示,与PEI/siRNA组(PP组)相比,靶向制剂组(STPP组)的NP mRNA、PA mRNA的表达水平更低,但是PB1 mRNA水平变化不大(P>0.05);Western blot结果表明,接毒后STPP组的NP蛋白表达量最低,显示了很好的抑制禽流感病毒NP蛋白表达的能力；IFA结果显示,STPP组的红色荧光最低,靶向制剂极大地抑制NP蛋白的表达,表现出很好的靶向抑制病毒复制的能力。动物实验结果表明,靶向制剂对H5N1流感病毒在小鼠肺内复制具有抑制作用,并对攻毒小鼠具有部分保护作用。其中,STPP组的小鼠存活率为60%,PP组的小鼠存活率为40%,而对照组小鼠全部死亡,差异显著(P<0.05; log-rank test)。结论细胞实验和动物实验结果显示,构建的靶向制剂可以有效降低接毒后流感病毒在MDCK细胞上的复制,可以降低攻毒后H5N1流感病毒在小鼠肺组织中的复制,还对攻毒后小鼠具有部分保护作用(生存率60%)。这些结果说明,这种靶向传递系统可以用于治疗H5N1亚型高致病性禽流感。第二章PA基因特异性siRNA抑制H5N1亚型高致病性禽流感病毒复制的研究目的设计针对H5N1亚型高致病性禽流感病毒PA基因的干扰RNA (siRNA),研究其在细胞水平和动物体内抑制流感病毒复制的效果。方法根据siRNA设计原则,设计并合成3对针对H5N1亚型高致病性禽流感病毒PA基因的siRNA,构建表达性质粒(ps-PA496, ps-PA1116, ps-PA1473),分别转染MDCK细胞并接毒,通过病毒滴度测定、real-time PCR和间接免疫荧光实验在细胞水平检测siRNAs抑制AIV复制的效果。根据细胞实验结果,选用有效的siRNA(ps-PA496)探讨其对H5N1流感病毒在小鼠肺内复制的抑制作用和攻毒保护作用。结果设计的3对siRNA1中,ps-PA496显著抑制AIV在MDCK细胞中的复制,病毒滴度与对照组相比降低78倍。Real-time PCR和间接免疫荧光实验结果表明,设计合成的3个siRNA均对PA基因的转录和表达产生显著的抑制作用,其中PA-496的抑制作用最强。体内实验表明,ps-PA496通过PEI尾静脉注射传递到肺组织后,能够有效降低H5N1 HPAIV感染小鼠的肺病毒滴度(P<0.05)；而且,ps-PA496组的攻毒小鼠体重减轻幅度较对照组小,且能够部分保护小鼠遭受致死性流感病毒的攻击(生存率37.5%)。结论本研究针对PAN的E154-R170保守区筛选并合成的ps-PA496具有最好的抗禽流感病毒复制的作用,为干扰RNA预防和治疗H5N1 HPAIV提供合理的技术支持和物质储备。同时,也提示PA的E154-R170保守区可以作为新型抗流感病毒药物设计和作用的靶标。

全文目录

第一章 H5N1亚型高致病性禽流感病毒 siRNA 靶向制剂的研究  7-63
  中文摘要  7-9
  英文摘要  9-11
  1.1 前言  11-28
    1.1.1 人禽流感的历史与现状  11-12
    1.1.2 H5N1亚型流感病毒的病原学基础  12-19
      1.1.2.1 流感病毒的分类与基因组结构  12-15
      1.1.2.2 流感病毒的复制  15-16
      1.1.2.3 H5N1亚型禽流感病毒的流行病学新特点  16-17
      1.1.2.4 禽流感病毒的种间传播机制  17-19
    1.1.3 H5N1亚型禽流感病毒的致病机理  19-22
      1.1.3.1 人H5N1禽流感的临床和病理表现  19
      1.1.3.2 血凝素与致病性关系  19-20
      1.1.3.3 神经氨酸酶与致病性的关系  20
      1.1.3.4 聚合酶与致病性的关系  20-21
      1.1.3.5 NS1蛋白与流感病毒致病性  21-22
    1.1.4 H5N1禽流感救治药物研究进展  22-28
      1.1.4.1 离子通道抑制剂  23-24
      1.1.4.2 神经氨酸酶抑制剂  24
      1.1.4.3 反义寡核苷酸  24-25
      1.1.4.4 RNA干扰  25
      1.1.4.5 治疗性抗体  25-26
      1.1.4.6 靶向制剂  26-28
  1.2 材料和方法  28-42
    1.2.1 材料  28-30
      1.2.1.1 病毒、细胞、菌株和实验动物  28
      1.2.1.2 质粒及主要试剂  28
      1.2.1.3 主要仪器  28-29
      1.2.1.4 主要试剂的配制  29-30
    1.2.2 方法  30-42
      1.2.2.1 PET28a-ScFv-Tail质粒的构建及重组蛋白ScFv-Tail的表达和活性鉴定  31-34
        1.2.2.1.1 PET28a-ScFv-Tail质粒的构建  31-32
        1.2.2.1.2 重组蛋白ScFv-Tail的表达、纯化和复性  32-34
        1.2.2.1.3 复性的重组蛋白ScFv-Tail的活性检测  34
      1.2.2.2 共表达三个siRNA质粒的构建  34-37
      1.2.2.3 不同N/P比对MDCK细胞生长(MTT)和转染效率的影响  37
      1.2.2.4 凝胶迁移阻滞实验  37-38
      1.2.2.5 靶向制剂的转染  38
      1.2.2.6 靶向制剂对流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用  38-41
      1.2.2.7 靶向制剂对H5N1亚型高致病性禽流感病毒在小鼠肺内复制的抑制作用  41
      1.2.2.8 靶向制剂对H5N1亚型高致病性禽流感病毒攻毒小鼠的保护作用  41-42
  1.3 结果  42-55
    1.3.1 重组质粒PET28a-ScFv-Tail的鉴定结果  42
    1.3.2 重组蛋白ScFv-Tail的表达、纯化和复性  42-44
    1.3.3 复性的重组蛋白活性检测——IFA  44
    1.3.4 共表达三个siRNA质粒的构建  44-46
    1.3.5 不同PEI与质粒的N/P比对MDCK细胞生长(MTT)和转染效率的影响  46-47
    1.3.6 凝胶阻滞实验鉴定靶向制剂结合性  47
    1.3.7 靶向制剂的转染  47-49
    1.3.8 靶向制剂抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制  49-52
    1.3.9 靶向制剂对H5N1亚型高致病性禽流感病毒在小鼠肺内复制的抑制作用  52-53
    1.3.10 靶向制剂对H5N1亚型高致病性禽流感病毒攻毒小鼠的保护作用  53-55
  1.4 讨论  55-62
    1.4.1 重组蛋白ScFv-Tail的原核表达  55-56
    1.4.2 聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导的核酸转染和释放  56-58
    1.4.3 具有靶向性的siRNA/DNA传递体系的构建  58-59
    1.4.4 问题与展望  59-62
  1.5 结论  62-63
第二章 PA基因特异性siRNA抑制H5N1亚型高致病性禽流感病毒复制的研究  63-91
  中文摘要  63-64
  英文摘要  64-65
  2.1 前言  65-72
    2.1.1 RNAi现象的发现  65-66
    2.1.2 RNAi的作用原理  66-68
    2.1.3 RNAi的作用特点  68
    2.1.4 RNAi在抗病毒研究中的应用  68-69
    2.1.5 RNAi技术在抗病毒过程中存在的问题与展望  69-72
  2.2 材料  72-73
    2.2.1 病毒与细胞  72
    2.2.2 主要试剂  72
    2.2.3 主要仪器  72
    2.2.4 实验动物  72
    2.2.5 溶液配制  72-73
    2.2.6 干扰RNA寡核苷酸链的设计和合成  73
  2.3 实验方法  73-78
    2.3.1 H5N1亚型高致病性禽流感病毒PA基因RNAi靶序列的设计与表达载体的构建  73-75
    2.3.2 siRNA对H5N1亚型流感病毒体外复制的影响  75-77
      2.3.2.1 siRNA对H5N1亚型流感病毒在MDCK细胞内复制的影响(TCID_(50))  75-76
      2.3.2.2 病毒TCID_(50)的测定  76
      2.3.2.3 反转录(RT)和实时定量PCR(Real-time PCR)检测siRNA对H5N1亚型流感病毒复制的影响  76-77
      2.3.2.4 间接免疫荧光实验(IFA)检测siRNA对H5N1亚型流感病毒蛋白的影响  77
    2.3.3 siRNA对H5N1亚型高致病性禽流感病毒体内复制的影响  77-78
    2.3.4 siRNA对H5N1亚型高致病性禽流感病毒攻毒小鼠的保护作用  78
  2.4 实验结果  78-85
    2.4.1 PA基因的siRNA靶序列的设计与表达载体的构建  78-80
    2.4.2 siRNA对H5N1亚型流感病毒在MDCK细胞中病毒滴度的影响  80-81
    2.4.3. Real-time PCR检测siRNA对PA基因mRNA、vRNA和cRNA的抑制作用  81-82
    2.4.4 间接免疫荧光实验(IFA)检测siRNA对H5N1亚型流感病毒蛋白表达的抑制  82-83
    2.4.5 siRNA(ps-PA496)对H5N1亚型高致病性禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用  83-84
    2.4.6 siRNA(ps-PA496)对H5N1亚型高致病性禽流感病毒攻毒小鼠的保护作用  84-85
  2.5 讨论  85-90
    2.5.1 siRNA的设计  85-86
    2.5.2 PA基因作为流感病毒RNA干扰的靶基因的意义  86-88
    2.5.3 聚乙烯亚胺介导的siRNA转染  88-89
    2.5.4 RNAi在抗病毒研究中的应用前景  89-90
  2.6 结论  90-91
参考文献  91-103
附录  103-104
缩略词  104-106
个人简历  106-107
致谢  107-108

H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究

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