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1.从人胚胎肺发育研究人原发性肺腺癌预后相关基因表达谱　2.深测序和基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究

作　者: 冯林
导　师: 程书钧；张开泰；高燕宁；徐宁志；林东昕
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 肺发育 肺癌 mRNA表达谱 预后 基因芯片 深测序 数字表达谱
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


该博士学位论文由相对独立的两部分工作组成。第一部分从人胚胎肺发育研究人原发性肺腺癌预后相关基因表达谱发育与肿瘤具有一定程度的相似性。从胚胎发育中探索和挖掘隐藏在肿瘤细胞内的恶性信息,为肿瘤基础及临床研究提供新的线索,正逐步成为一个新的研究方向。本研究从三个方面观察了影响原发性肺癌预后的分子事件在胚胎肺发育过程中的变化规律：1)人胚胎肺发育的mRNA表达特征：2)人胚胎肺发育与原发性肺癌基因表达谱相似性比较；3)人胚胎肺发育相关基因对原发性肺癌预后的影响。研究结果显示,胚胎肺发育在组织学层面的时空变化与分子水平的mRNA表达具有动态联系,在我们所关注的两个基因簇中,其mRNA表达随发育的进程而呈现此消彼长、互呈X状走向的表达模式。高开低走型表达模式的基因簇与细胞增殖相关；而低开高走型基因簇则和细胞与细胞、细胞与间质通讯,胞膜成熟相关。根据基因表达特征,将原发性肺腺癌与肺鳞癌投射到胚胎肺发育的动态模式中,发现肿瘤样本间的异质性明显大于正常组织；与非肿瘤成人肺相比,肺腺癌的基因表达特征与胚胎肺组织相似,肺鳞癌则与更早期肺组织相似。根据基因表达的动态分布特征,以SMC4为代表的、在胚胎肺发育过程中表达丰度呈高开低走型的基因群在肺癌组织中的表达则重新上调。进一步分析发现,SMC4基因群总体表达水平与肺腺癌患者临床预后有关,并且不依赖于患者的临床分期、淋巴结转移情况等；但却未发现它们与肺鳞癌患者临床预后有关。SMC4基因群作为分子表型与肺腺癌患者临床表型的相关性,在多组公共数据库来源的独立样本中均得到了验证。本研究结果提示,人胚胎肺发育组织与原发性肺癌在分子水平存在共性；与肺癌患者预后相关的恶性分子事件可能是胚胎记忆的重新唤起。以胚胎发育作为切入点,系统整合分析胚胎发育与肿瘤的内在联系,不失为一条探索肿瘤发生与发展机理的新途径。第二部分深测序和基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究基于第二代测序的数字表达谱技术(next-generation sequencing based Digital Gene Expression tag profiling, DGE)已经开始用于基因表达谱研究。为了评价DGE测序平台和基因芯片平台对mRNA表达谱的检测质量,我们分别对这两个平台在基因表达谱检测能力、技术重复性、动态范围和检测结果间的一致程度等主要技术指标进行了测评。检测对象是转染了DENND2D基因和空载体的NCI-H1299细胞系的mRNA表达谱。结果显示,在两种细胞内,基因芯片平台共检测到17,362个基因,DGE测序平台共检测到15,938个,其中13,221个基因为两平台共同检测到的基因。两技术平台内两次技术重复间的相关系数均大于0.99,变异系数小于9%。基因芯片平台的动态范围固定在4个数量级,而DGE平台的动态范围根据其测序深度的不同是可拓展的。两平台检测结果的一致性高,特别是对于那些丰度较高的基因。相比于DGE测序平台,基因芯片平台更难检测出表达丰度低的基因。虽然基因芯片技术或许最终会被深测序(deep sequencing)技术取代,但由于基因芯片的成本优势,以及已经建立的硬件和数据分析基础,短期内该平台还将是基因表达谱研究领域的重要技术手段。

全文目录


目录  3-8
图表索引  8-11
中英文缩略词  11-14
中文摘要  14-16
英文摘要  16-18
论文综述:潜在肿瘤标志物的发现研究  18-34
  1.肿瘤流行病学变化趋势  18-20
  2.肿瘤标志物应用潜力巨大  20-21
  3.单一肿瘤标志物检测不能满足临床实践需要  21-25
    3.1 肿瘤的高度异质性  21-22
    3.2 评价指标的局限性  22-24
    3.3 技术水平的限制  24-25
  4.建立联合检测模型,解决单一标志物难以克服的难题  25-26
  5.目前建立联合检测模型的两种策略  26-31
    5.1 以候选物为基础的研究  26-28
    5.2 以发现为基础的研究  28-31
  6.道法自然——以模型为基础的研究  31-32
  7.结语  32-34
第一部分 从人胚胎肺发育研究人原发性肺腺癌预后相关基因表达谱  34-91
  前言  34-36
  材料和方法  36-57
    1.实验材料  36-41
      1.1 肺癌组织标本  36-37
      1.2 发育过程中的胚胎组织标本和良性肺疾患患者非病变肺组织  37
      1.3 细胞系  37-38
      1.4 实时定量PCR引物序列  38
      1.5 主要试剂或试剂盒  38-40
      1.6 主要仪器  40-41
      1.7 主要控制和生物信息学分析软件  41
    2.实验方法  41-53
      2.1 新鲜组织标本的收集  41-43
      2.2 肺癌标本的组织病理学鉴定  43
      2.3 新鲜组织样本基因组DNA的提取  43
      2.4 总RNA样品的制备与鉴定  43-45
      2.5 利用基因芯片检测mRNA表达谱  45-50
      2.6 逆转录合成cDNA  50
      2.7 Sybr Green法实时定量PCR  50-51
      2.8 RNA干扰实验  51-53
      2.9 免疫组织化学染色  53
    3.mRNA表达谱数据分析  53-57
      3.1 从公共数据库获得肺癌芯片数据集  54
      3.2 mRNA表达谱芯片数据预处理  54
      3.3 计算确定SMC4相关发育基因群  54-55
      3.4 评价肿瘤患者肿瘤组织中SMC4基因群总体表达水平  55-56
      3.5 评价SMC4基因群总体表达水平与肿瘤患者临床预后的关系  56
      3.6 其他  56-57
  结果  57-84
    1.胚胎肺发育过程中mRNA表达模式  57-62
      1.1 人胚胎肺发育过程中4个不同时相点组织总mRNA表达谱  57
      1.2 人肺发育过程中不同时相点组织mRNA表达的总体特征  57-58
      1.3 人肺发育过程中不同时相点组织mRNA表达的动态特征  58-61
      1.4 典型基因表达模式体现发育组织mRNA表达谱携带的发育信息  61-62
    2.胚胎肺发育与原发性肺癌mRNA表达谱的整合分析  62-67
      2.1 与发育样本相比,肺癌样本间mRNA表达谱异质性大  62-64
      2.2 原发性肺癌组织mRNA表达谱在依据发育样本构建的地貌图中的投影位置  64-65
      2.3 相邻时相发育组织间差异表达基因在肺腺癌和肺鳞癌中的表达趋势  65-67
    3. SMC4基因在发育-肺癌组织中的表达及其对细胞增殖的影响  67-70
      3.1 SMC4基因mRNA在发育-肺癌组织中顺序表达模式呈"碗"形结构  67-68
      3.2 SMC4基因在肺癌组织内DNA拷贝数和蛋白质表达改变  68-69
      3.3 下调SMC4基因水平,永生化支气管上皮细胞增殖能力下降  69-70
    4. SMC4相关基因群的确立和mRNA表达模式分析  70-71
      4.1 与SMC4表达模式相似的基因群的筛选  70
      4.2 SMC4基因群在发育-肺癌组织中的顺序表达模式高度一致  70-71
    5. SMC4基因群总体表达水平与肺癌患者临床预后的关系  71-84
      5.1 SMC4基因群总体表达水平与肺腺癌患者临床预后有关  71-81
      5.2 SMC4基因群总体表达水平与肺鳞癌患者临床预后无显著相关  81-84
  讨论  84-90
    1. 从肿瘤的分子表型预测临床表型  84-86
      1.1 形态学不能精确反映肿瘤患者的生物学行为和临床表型  84
      1.2 肿瘤的分子表型可以更好的反映患者临床表型  84-85
      1.3 描绘肿瘤的分子表型需要巧妙精密的实验设计  85
      1.4 在"跳出肿瘤看肿瘤"战略思想指导下巧妙设计,探索体现肿瘤临床表型的分子表型  85-86
    2. 肿瘤与发育关系密切又复杂  86-90
      2.1 对胚胎发育的研究,揭示出肿瘤与发育过程具有相似性  86-87
      2.2 人肺发育过程中的动力系统和控制系统与肺癌临床表型的关系  87-88
      2.3 肿瘤与发育关系的组织特异性  88-90
  小结  90-91
第二部分 深测序和基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究  91-115
  前言  91-93
  材料和方法  93-101
    1. 实验材料  93-96
      1.1 细胞系  93
      1.2 质粒  93
      1.3 主要试剂或试剂盒  93-94
      1.4 主要仪器  94-96
      1.5 主要控制和生物信息学分析软件  96
    2. 实验方法  96-99
      2.1 质粒构建和细胞转染  96
      2.2 细胞总RNA制备和鉴定  96-97
      2.3 基因芯片mRNA表达谱检测  97
      2.4 以测序技术为基础的数字基因表达标签谱检测  97-98
      2.5 实时定量PCR检测  98-99
    3. 规定的两个评价参数  99-100
      3.1 %CV-estimated(%CVe)  99
      3.2 OP_(left)&OP_(rght)  99-100
    4. 原始数据的预处理  100-101
  结果和讨论  101-114
    1. Agilent基因芯片平台和DGE测序平台检测基因数量的比较  101-103
      1.1 两平台分别检测的基因总量  101
      1.2 两平台各自检出的独有基因  101-103
    2. Agilent基因芯片平台和DGE测序平台重复性比较  103-106
      2.1 平台内技术重复检测结果的相关性比较  103-104
      2.2 平台内重复检测变异程度的比较  104-106
    3. Agilent基因芯片平台和DGE测序平台检测动态范围的比较  106-107
    4. Agilent基因芯片和DGE测序平台结果一致性比较  107-110
      4.1 两平台与实时定量PCR平台检测结果的比较  107-109
      4.2 Agilent基因芯片平台和DGE测序平台检测结果的一致性  109-110
    5. 不同基因相对表达水平的检测  110-111
      5.1 利用DGE测序平台可获得基因间相对表达水平的信息  110-111
      5.2 常用内参基因GAPDH和ACTB是高丰度基因  111
    6. Agilent基因芯片平台和DGE测序平台检测差异表达基因的比较  111-114
      6.1 Agilent基因芯片平台未检出DENND2D的表达变化  111-112
      6.2 Agilent基因芯片与DGE测序平台对基因表达倍数变化检测的比较  112-114
  小结  114-115
参考文献  115-121
基金资助  121-122
致谢  122-124
个人简历  124

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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