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玉米C_4途径关键酶（PEPC、PPDK）基因的克隆及PEPC基因对小麦的遗传转化

作　者: 李艳
导　师: 许为钢；崔党群
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC) 丙酮酸磷酸双激酶(PPDK) 基因克隆转基因植株光合速率
分类号: S513
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

小麦为我国的重要粮食作物,其生产能力及供需状况始终关系到我国国民经济发展和粮食安全等重大战略问题。随着我国社会经济的发展和人口的增加,人们对于粮食的需求日益增长。光合作用是一切绿色植物物质生产的基础,因此,提高作物产量的关键是提高光能利用效率,从而提高单位面积的产量。C4植物如玉米、高粱、甘蔗等具有CO2浓缩机制,光补偿点高,CO2补偿点低,光呼吸弱,特别在高温、干旱等逆境条件下,比C3植物小麦、水稻等有较高的光合效率。将C4途径关键酶基因引入C3植物以提高其光合效率和籽粒产量,一直是国内外生物学研究领域的前沿问题。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是C4光合途径中的关键酶,其主要分布在C4植物的叶肉细胞的细胞质内,形成CO2的浓缩机制为维管束鞘细胞的C3途径提供CO2,起“CO2泵”的作用。磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)催化的反应是C4代谢途径中的限速步骤,是C4光合途径过程中另一个备受关注的酶,此酶位于叶肉细胞的叶绿体中,催化CO2最初受体PEP的再生。许多研究已表明,将C4型pepc基因转入C3作物可以提高C3作物的光合效率和产量潜力。为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦新品系,我们从光合效率和PEPC酶活性均较高的玉米自交系Z561中克隆出C4型pepc基因和ppdk基因的cDNA,通过基因枪介导法将玉米C4型pepc基因导入到小麦中,为提高小麦品种的光合效率和转基因高光效育种提供必要的理论和技术材料支撑。主要结果如下:1.利用同源克隆技术,从玉米中克隆了C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA。PEPC的核苷酸序列分析表明,该片段全长3053bp,包含一个2910bp长的开放阅读框,编码970个氨基酸。与已登陆的玉米pepc基因(X15238)相比,序列同源性可达99%。核苷酸序列中存在16处碱基差异,导致蛋白质水平上有5处非连续性排列的氨基酸差异,并未影响到该酶的酶活性。编码区核苷酸序列与甘蔗C4型、高粱C4型、谷子C4型同源率分别达到91%、90.2%、83.2%,与水稻C3型、高粱C3型、谷子C3型、稗草C3型同源率分别为74.1%、75.1%、76.8%、75.7%。氨基酸序列进化树分析表明,所克隆的玉米C4型PEPC与甘蔗和高粱的C4型遗传距离最近,而与谷子C4型次之。编码蛋白质的功能位点分析表明,玉米PEPC蛋白质氨基酸序列有7个保守区。2.利用同源克隆技术,从玉米中克隆了C4型磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)基因的cDNA。PPDK序列测定结果表明,PCR合成片段长度为3014bp,包括一个2757bp长的开放阅读框。与已登陆的玉米ppdk基因(J03901)相比,序列同源性可达92.94%,3.利用从玉米中克隆的C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体。将玉米C4型PEPC cDNA序列插入双元表达载体pCAMBIA3301中,构建了p3301-pepc融合表达载体。4.利用基因枪介导法将p3301-pepc高效表达载体导入6个小麦品种(系)中,共获得409株抗性再生植株,其中有357株PCR扩增结果呈阳性。Southern杂交结果表明玉米C4型pepc基因已整合到小麦基因组中。利用实时荧光定量PCR方法分析转基因小麦植株的拷贝数,在15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株。RT-PCR分析结果表明外源基因在小麦基因组中得到正确转录,且不同转基因植株pepc基因的表达量存在较大差异。5.对T1代转基因小麦植株进行PCR检测和遗传分析,结果表明大部分转基因植株的分离比例符合孟德尔显性单基因遗传分离规律,外源基因在T0代转基因植株中整合情况良好,而且能够稳定的遗传给后代;对T1代部分转基因植株进行PEPC酶活性测定,结果显示部分转基因植株的PEPC酶活性得到了提高,最高的酶活性是对照植株的2.17倍,SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明不同转基因植株间pepc基因表达水平存在差异,酶活性较高的转基因植株,其pepc基因表达水平亦高;对田间种植的T1代转基因小麦植株和对照植株进行叶片净光合速率测定,结果显示,与对照植株相比,除个别T1代转基因小麦植株净光合速率与对照差异不明显,大部分转基因小麦植株的光合速率得到明显提高,最高值达到31.95μmolCO2m-2s-1,比对照提高了26%,明显高于本生态区小麦物种已有报道的最高表达值,为高光效转基因小麦新品种的选育、小麦高光效转基因育种理论与方法的研究工作提供了重要材料。

全文目录

致谢  4-9
缩略词表  9-10
摘要  10-12
第一章文献综述  12-32
  1.1 C_4作物与C_3作物光合作用途径的异同  12-13
  1.2 高光效基因工程育种  13-15
  1.3 C_4光合作用途径关键酶基因的分子生物学研究进展  15-18
    1.3.1 PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）  15-16
    1.3.2 PPDK (磷酸丙酮酸二激酶)  16-18
    1.3.3 NADP-ME（依赖于NADP 的苹果酸酶）  18
  1.4 C_4光合作用途径基因工程研究进展  18-22
    1.4.1 PEPC 基因工程研究进展  19-20
    1.4.2 PPDK 基因工程研究进展  20
    1.4.3 NADP-ME 基因工程研究进展  20-22
  1.5 影响C_3植物中C_4途径酶活性表达的因素  22-23
    1.5.1 环境因子的影响  22
    1.5.2 生长发育的影响  22-23
    1.5.3 同种作物不同品种间叶片中C_4 途径酶活性表达差异  23
  1.6 利用转C_4光合酶基因改善C_3植物光合特性的可行性及可能存在的问题..  23-24
  1.7 小麦遗传转化研究进展  24-30
    1.7.1 基因枪法  25-27
      1.7.1.1 基因枪法原理及在小麦遗传转化上的应用  25
      1.7.1.2 基因枪法的优缺点  25
      1.7.1.3 影响基因枪法转化小麦的因素  25-27
    1.7.2 农杆菌介导法  27-29
      1.7.2.1 农杆菌介导法的原理及在小麦遗传转化上的应用  27-28
      1.7.2.2 农杆菌介导法的优缺点  28
      1.7.2.3 影响农杆菌介导法转化小麦的因素  28-29
    1.7.3 花粉管通道法  29-30
    1.7.4 电激法和PEG 介导基因转化  30
    1.7.5 脂质体介导基因转化  30
  1.8 本研究目的与意义  30-32
第二章玉米C_4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和磷  32-46
  2.1 材料和方法  32-37
    2.1.1 试验材料与试剂  32
    2.1.2 RNA 提取与PCR 扩增  32-34
    2.1.3 目的基因片段的克隆与序列测定  34-37
  2.2 结果与分析  37-44
    2.2.1 玉米C_4 型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆与序列测定  37-38
    2.2.2 玉米C_4 型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的序列同源性检索及多重比对分析  38-40
    2.2.3 玉米C_4 型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的分子系统进化分析  40
    2.2.4 玉米C_4 型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的蛋白质结构域和功能位点分析  40-42
    2.2.5 玉米磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）基因的克隆与序列测定  42
    2.2.6 玉米磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）基因的序列同源性检索及多重比对分析  42-44
    2.2.7 玉米磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）基因的蛋白质结构域分析  44
  2.3 讨论  44-46
第三章玉米C_4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因高  46-65
  3.1 材料与方法  46-51
    3.1.1 植物材料  46
    3.1.2 菌株与质粒  46
    3.1.3 酶及试剂  46
    3.1.4 培养基  46
    3.1.5 植物双元表达载体的构建  46-47
    3.1.6 基因枪法转化小麦  47-48
    3.1.7 再生植株的鉴定  48-51
  3.2 结果与分析  51-63
    3.2.1 玉米C_4 型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因高效双元表达载体的构建  51-53
    3.2.2 玉米C_4 型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的遗传转化与转基因植株的鉴定  53-63
  3.3 讨论  63-65
    3.3.1 表达载体的选择  63
    3.3.2 抗性愈伤的筛选  63
    3.3.3 转基因植株拷贝数的确定  63-64
    3.3.4 转基因植株光合生理指标的测定  64-65
第四章转玉米C_4型PEPC 基因小麦T1 代植株的  65-73
  4.1 材料与方法  65-67
    4.1.1 植物材料  65
    4.1.2 T1 代转基因小麦株系的PCR 检测与遗传分析  65-66
    4.1.3 T1 代转基因小麦植株的PEPC 酶活性检测  66
    4.1.4 玉米C_4 型PEPC 基因所编码蛋白质的SDS-PAGE 凝胶电泳  66-67
    4.1.5 T1 代转基因小麦植株净光合速率测定  67
  4.2 结果与分析  67-71
    4.2.1 T1 代转基因小麦株系的PCR 检测与遗传分析  67-68
    4.2.2 T1 代转基因小麦植株的PEPC 酶活性检测  68-69
    4.2.3 玉米C_4 型PEPC 基因所编码蛋白质的SDS-PAGE 凝胶电泳结果  69-70
    4.2.4 T1 代转基因小麦植株净光合速率测定结果  70-71
  4.3 讨论  71-73
    4.3.1 T1 代转基因小麦植株的遗传分析  71
    4.3.2 T1 代转基因小麦植株的生理特征  71-73
参考文献  73-86
ABSTRACT  86-89
作者简历  89

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