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苎麻的分子育种研究

作　者: 蒋建雄
导　师: 李宗道
学　校: 湖南农业大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 苎麻根癌农杆菌转化 Bar基因转基因植株棉花总DNA导入性状变异
分类号: S563.103
类　型: 博士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

为了提高苎麻育种效率，创造高产优质的苎麻新种质材料，本研究探索了将植物基因工程技术和外源总DNA导入技术应用于苎麻品种改良的可行性，并获得了如下结果。1．建立了高效的苎麻转基因植株再生体系对“湘苎3号”苎麻的茎段、子叶、带柄子叶、下胚轴等外植体的不定芽分化能力进行了比较，结果认为下胚轴分化频率高，材料制备容易，适宜用作苎麻遗传转化的受体，但从下胚轴上产生丛生芽的频率比较低。不同的组织培养条件下，下胚轴上不定芽分化频率高低依次为昼夜变温光照培养（日温26-28℃，夜温18-20℃）＞恒温暗培养（26-28℃）＞恒温光照培养（26-28℃），说明下胚轴再分化对温度变化的敏感性高于光照。研究还表明，苎麻外植体极易分化出根，但这个过程仍需要外源生长素的诱导。在仅添加了BA的分化培养基上，下胚轴脱分化和再分化都比较困难，而BA和IAA配合使用时却能很好地促进下胚轴的脱分化和再分化。不同BA和IAA配比组合中下胚轴的不定芽分化率存在差异，其中以BA2.0-3.0mg/l＋IAA0.5mg/l组合的不定芽分化率最高，均达到了70％左右。此外，分化培养基中添加1mg/lAgNO₃在一定程度上也可以促进下胚轴上不定芽的分化。2．实现了农杆菌介导抗除草剂基因转化苎麻通过对影响根癌农杆菌转化效率的因素进行优化，建立了农杆菌介导外源抗除草剂Bar基因转化苎麻的遗传转化体系。结果表明，苎麻是一种对除草剂很敏感的植物，其耐除草剂“Basta”的临界浓度约为0.3mg/l，而且Basta对不定芽分化的抑制尤为明显。羧苄青霉素可以促进下胚轴上丛生芽的发生，但对不定芽生根的抑制作用不明显。同时苎麻下胚轴对根癌农杆菌菌株的敏感性高，容易被感染和转化，下胚轴与农杆菌共培养1-2d后其GUS瞬间表达率均接近100％。EHA105菌株比较适宜用于苎麻下胚轴的遗传转化，其合适的感染方式是将下胚轴外植体在用1/2MS液体培养基重新悬浮并稀释至浓度为OD₆₀₀=0.1-0.2的菌液中感染5min。下胚轴的预培养时间以及下胚轴与农杆菌的共培养时间对转化效率的促进作用都比较大，其中以预培养6-9d和共培养4d的转化效果达到最佳。试验还表明GUS瞬间表达率和GUS稳定表达率以及抗性愈伤组织中阳性转化体的百分率三者之间并不总是呈紧密的平行关系，因此综合考虑这三个参数来优化苎麻遗传转化体系是很有必要的。此外，本研究发现通过在X-Gluc缓冲液中加入6％PVP，可以有效地防止GUS组织化学显色过程中苎麻材料的严重褐化，而对其显色效果无不良影响。通过筛选培养，最后获得了21株抗性植株，经GUS组织化学显色和DNA点杂交鉴定出8株含有抗除草剂草丁磷的Bar基因同源片段的转基因芒麻植株。 3．棉花总 DNA导入芒麻引起了性状变异应用超干胚浸渍法，成功地将棉花总DNA导入到芒麻细胞内，在D；代获得了两株叶型发生奇特变异的新材料97－24和97－25。其中97－24的D。代发生分离，大部分子代植株恢复了受体性状，只有少数子代植株叶型的变异比D；代植株更加明显。而由 97．24地下茎发生的分株上则呈现自下而上叶型变异逐渐恢复的趋势。在另一植株 97－28的D。代中又筛选到一株叶背无茸毛的变异株，其生长势弱，叶色黄绿，易受虫害。它在D。代也发生了分离，只有约l／4的子代植株仍保持了上一代的变异。但从97－28 的D。代植株地下茎发生的分株却均能稳定地保持这些变异性状，说明外源总DNA导入引起的变异在低世代即可通过无性繁殖方式固定下来，这非常有利于缩短芒麻育种周期。在试管苗快速繁殖中，大多数变异材料在H基本培养基上生根良好，但在MS 基本培养基上则生根困难，这从细胞学的角度证明变异后代在遗传基础上确实发生了改变。IEInPD分析结果也证明部分棉花DNA片段已经整合入芒麻基因组，并导致芒麻基因组序列发生了一定的变化。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
缩略词表  8-9
前言  9-16
  一苎麻育种研究的现状  9-10
  二植物遗传转化技术在麻类作物中的应用  10
  三关于本研究中所采用的两种遗传转化技术  10-16
    （一）农杆菌介导法  10-13
    （二）种胚浸渍法  13-16
第一章根癌农杆菌介导抗除草剂基因转化苎麻的研究  16-41
  1 材料与方法  16-21
  2 结果与分析  21-36
    2．1 苎麻转基因植株再生体系的建立  22-28
      2．1．1 不同类型外植体不定芽分化能力的差异  22
      2．1．2 培养条件对下胚轴不定芽分化的影响  22-23
      2．1．3 NAA、2，4-D、IAA对下胚轴组织分化的影响  23-24
      2．1．4 BA对下胚轴不定芽分化的影响  24-25
      2．1．5 不同激素配比对下胚轴不定芽分化的影响  25-26
      2．1．6 AgNO_3对不定芽分化的影响  26-27
      2．1．7 转基因植株再生体系的建立  27-28
    2．2 根癌农杆菌介导的外源Bar基因导入  28-35
      2．2．1 下胚轴对Basta筛选压力的耐性测定  28
      2．2．2 下胚轴对不同农杆菌菌株的敏感性  28-29
      2．2．3 农杆菌不同感染方式对转化率的影响  29-30
      2．2．4 下胚轴预培养时间对转化率的影响  30-31
      2．2．5 下胚轴与农杆菌共培养时间对转化率的影响  31-33
      2．2．6 PVP对GUS显色效果的影响  33
      2．2．7 羧苄青霉素对下胚轴组织分化的影响  33-34
      2．2．8 根癌农杆菌介导转化苎麻的操作程序  34-35
    2．3 抗除草剂转基因植株的再生  35-36
      2．3．1 抗性植株的获得  35-36
      2．3．2 抗性植株的GUS组织化学显色鉴定  36
      2．3．3 转基因植株的DNA点杂交  36
  3 讨论  36-41
第二章棉花总DNA导入苎麻引起性状变异的研究  41-49
  1 材料与方法  41-43
  2 结果与分析  43-47
    2．1 导入后代变异植株的获得  43
    2．2 棉花总DNA导入苎麻产生的植物学性状变异  43-45
      2．2．1 变异性状类型  43-44
      2．2．2 变异性状在有性世代中的传递规律  44
      2．2．3 变异性状在无性世代中的传递规律  44-45
    2．3 变异株的试管苗快速繁殖  45-46
    2．4 变异子代与供体、受体RAPD扩增的比较分析  46-47
  3 讨论  47-49
参考文献  49-55
图版  55-62
致谢  62-63
作者简历  63

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