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miR-146a在脂多糖诱导肺泡巨噬细胞中的动态表达及与TNF-a的相关性分析

作　者: 丁成志
导　师: 钱克俭
学　校: 南昌大学
专　业: 急诊医学
关键词: 微小RNA-146a 肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子-α 实时荧光定量PCR
分类号: R563.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：观察miR-146a和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在脂多糖(LPS)诱导的肺泡巨噬细胞中的动态表达,分析两者在时间上的变化关系,探讨miR-146a对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用及其机制。方法：将体外培养的NR8383肺泡巨噬细胞按1×106个/mL接种于六孔板,贴壁90min后加入1μg/mL的LPS,刺激0h、3h、6h、12h后离心收集培养上清液和细胞团块。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测细胞中miR-146a和TNF-αmRNA的表达情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养上清液中TNF-α蛋白水平的表达。miR-146a和TNF-αmRNA的相关性采用双变量Pearson相关性分析。结果：1.LPS刺激6h后,细胞中的miR-146a表达水平开始增高(5.33±0.81倍,P<0.01),并且持续增高(12h：8.21±1.19倍,P<0.01)；2.LPS刺激3h后,细胞中TNF-a mRNA的表达即达到顶峰(67.48±24.52倍,P<0.01),6h后开始降低(29.53±4.26倍,P<0.05)；3.培养上清液中的TNF-α蛋白在LPS刺激3h后即升高(359.80±57.54pg/mL,P<0.01),于12h达高峰(729.22±50.40pg/mL,P<0.01)；4.细胞中miR-146a的表达水平与TNF-αmRNA的含量呈负相关(r=-0.895,P<0.01)。结论：LPS刺激0-12h后,miR-146a和TNF-α的表达呈现一定的动态变化,且细胞中miR-146a的表达水平与TNF-αmRNA的含量呈负相关,推测miR-146a可能参与了肺泡巨噬细胞的炎症反应调控。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
主要英文缩略词表  8-10
第1章引言  10-12
第2章材料与方法  12-24
  2.1 实验材料  12-13
    2.1.1 细胞  12
    2.1.2 主要试剂  12-13
    2.1.3 主要仪器与设备  13
  2.2 器材的准备及主要试剂的配置  13-14
    2.2.1 细胞培养用品的处理  13-14
    2.2.2 去RNA酶处理  14
    2.2.3 Ham's F-12K培养基的配制  14
    2.2.4 LPS溶液的配制  14
  2.3 实验方法  14-24
    2.3.1 NR8383细胞的培养、传代、冻存与复苏  14-15
    2.3.2 细胞处理及分组  15
    2.3.3 总RNA抽提、定量和质量检测  15-16
    2.3.4 SYBR Green IRT-qPCR检测细胞TNF-αmRNA的表达  16-19
    2.3.5 TaqMan RT-qPCR检测细胞miR-146a的表达  19-21
    2.3.6 ELISA检测上清中TNF-α蛋白的表达  21-23
    2.3.7 统计学处理  23-24
第3章结果  24-29
  3.1 细胞形态学改变  24
  3.2 总RNA琼脂糖凝胶电泳  24-25
  3.3 扩增产物琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析  25-26
  3.4 TNF-A MRNA在脂多糖诱导NR8383细胞中的动态表达变化  26
  3.5 MIR-146A在脂多糖诱导NR8383细胞中的动态表达变化  26-27
  3.6 TNF-A蛋白在培养上清液中的动态表达变化  27
  3.7 相关性分析  27-29
第4章讨论  29-34
第5章结论与展望  34-35
  5.1 结论  34
  5.2 进一步工作的方向  34-35
致谢  35-36
参考文献  36-39
附录综述  39-45
  参考文献  42-45
攻读学位期间的研究成果  45

miR-146a在脂多糖诱导肺泡巨噬细胞中的动态表达及与TNF-a的相关性分析

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