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热休克蛋白60抗原、抗体和70抗体在冠心病发病中的作用

作　者: 张晓敏
导　师: 邬堂春
学　校: 华中科技大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 热休克蛋白60 热休克蛋白70 抗体冠心病高血压糖尿病联合作用单核苷酸多态性
分类号: R541.4
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

冠心病(coronary heart disease, CHD)是一种多病因的疾病,确切的发病机制尚不清楚,自身免疫反应被认为是其中重要的发病机制之一。热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一类高度免疫原性的蛋白,能够作为自身抗原提呈给免疫系统,产生自身抗体,在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥重要作用。本研究组的前期工作发现多种环境有害因素(如:高温、噪声、苯、多环芳烃等)导致了血浆Hsp抗体的出现与增加,而且与许多疾病(如:中暑、噪声性耳聋、苯中毒、肺癌等)的发生发展有关,特别是血浆Hsp70抗体的出现与心电图异常密切相关,提示Hsp70抗体的出现与心血管疾病之间可能存在着病因学的联系。然而,有关Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体在CHD发病过程中的确切作用仍不太清楚,并且,循环中共存的抗原和抗体是否在CHD的发病中有着联合或干扰作用,也未见报道。由于CHD的发病和循环的Hsp抗原水平在不同种族的人群中存在着显著性差异,可见遗传变异可能对Hsp抗原、抗体的产生和疾病的发生有重要影响。本教研室已经发现hsp70-1基因上rs1043618位点单核苷酸多态性(SNP)与CHD危险度有关,但hsp基因多态性是否通过改变血浆Hsp抗原、抗体水平进而影响CHD的易感性,迄今未见报道。因此,本课题以Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体与CHD的关系为研究主线,通过检测Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体在病例-对照人群血浆中的水平,探讨它们与CHD发病风险及其病变严重程度的关系,重点研究Hsp60抗原与抗体,以及和CHD其它危险因素如高血压、糖尿病和吸烟等因素对CHD可能的联合作用。并选取hsp60和hsp70基因上的标签SNP(tagSNP),研究这些SNPs位点的不同基因型对血浆Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体水平的影响;同时,对急性心肌梗塞(AMI)发病过程中的Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体水平进行动态观察,以探讨Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体在CHD中变化的原因。本研究以人群为研究对象,采用病例-对照研究和前瞻性研究,以期为CHD发病机制的探讨提供科学依据。本研究共分以下三部分:第一部分Hsp60抗原、抗体与冠心病的关系本部分主要对血浆Hsp60抗原和抗体与CHD发病风险及其病变程度的关系,Hsp60抗原和抗体与其它CHD危险因素对CHD的联合作用以及hsp60基因多态性对Hsp60抗原、抗体水平的影响进行探讨。依据WHO诊断标准或经冠脉造影显示有一支或一支以上冠脉狭窄≥50%作为CHD诊断标准,从武汉三家三甲医院住院患者中共选取40-79岁CHD病人1003例,以年龄±5?岁和性别以1:1与CHD组频率匹配选取1003例与CHD居住区域相同的居民作为对照。采用本教研室以前的测序结果并结合HapMap数据库资料,选取4个标签tagSNP:rs2340690、rs788016、rs2565163和rs2305560,运用TaqMan技术进行基因分型,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆Hsp60抗原、抗体水平,以探讨Hsp60抗原、抗体与CHD以及hsp60基因多态性与Hsp60抗原、抗体水平的确切关系。对Hsp60抗体与CHD关系的研究结果显示:CHD组Hsp60抗体水平显著高于对照组[41.56(29.76-59.53) vs. 35.85(25.96-52.13) U/ml, P=0.000],但心肌梗塞(MI)、不稳定心绞痛(UA)和稳定心绞痛(SA)患者中,Hsp60抗体水平无显著性差异。CHD组和对照组中有高血压或糖尿病者的Hsp60抗体水平均显著高于正常血压或血糖者,有显著性差异(P<0.05)。长期使用他汀类和/或阿司匹林的患者Hsp60抗体水平显著下降(P<0.05)。多元logistic回归分析提示Hsp60抗体的出现是CHD发生的显著危险因素,高水平Hsp60抗体(>中位数,38.42U/ml)的个体发生CHD的危险度是低Hsp60抗体水平(≤中位数,38.42U/ml)个体的1.79倍。随着Hsp60抗体水平的升高,个体患CHD的风险以及CHD的严重程度(以血管病变的支数评估)以剂量-反应关系显著增加。校正其他因素后,以低水平Hsp60抗体(<25th)为参考,高水平Hsp60抗体(≥75th)的个体发生CHD的风险为2.34(95%CI, 1.76-2.98, P =0.000);有多支血管病变(≥2支病变)的风险为3.67 (95% CI, 1.57-8.64, P=0.003)。有高水平Hsp60抗体的高血压个体比较低水平Hsp60抗体的正常血压的个体,患CHD的风险是5.17倍(95%CI, 3.95-6.75);同样,有高水平Hsp60抗体的糖尿病个体比较有低水平Hsp60抗体的正常血糖的个体,患CHD的风险是为6.49 (95%CI, 4.52-9.33)。有高水平Hsp60抗体且合并高血压和糖尿病的个体比较低水平Hsp60抗体的正常血压和血糖的个体,患CHD的风险显著增加到20.99 (95%CI, 12.50-35.24)。对Hsp60抗原与CHD关系的研究结果显示:CHD组的Hsp60抗原水平显著高于对照组[171.4(92.78-319.67) vs.128.7 (60.05-250.17) ng/ml, P =0.000]。不同类型的CHD中Hsp60抗原水平无差异(P >0.05),用药对Hsp60抗原水平并不影响。Hsp60抗原在对照中的检出率为40.6%,CHD中的检出率为47.8%,无显著性差异,但Hsp60抗原水平>1000ng/mL在对照组和CHD组分别占1.2%和7.0%,有极显著性差异(P =0.000)。多元logistic回归分析表明Hsp60抗原的出现与CHD的发生有显著性联系(P = 0.009),有Hsp60抗原的个体发生CHD的危险度是没有Hsp60抗原个体的4.14倍。随着Hsp60抗原水平的升高,个体患CHD的风险显著增加,差异有极显著性,趋势检验P=0.000。校正混杂因素后,以低水平Hsp60抗原(<25th)为参考,高水平Hsp60抗原(≥75th)的个体发生CHD的风险为4.87(95%CI,3.06-7.76),但Hsp60抗原与CHD的严重程度并无关系(P >0.05)。比较低水平的Hsp60抗原≤中位数(160.24ng/mL)和抗体≤中位数(38.42U/mL),有高水平Hsp60抗原>中位数(160.24ng/mL)和抗体>中位数(38.42U/mL)的个体患CHD的风险为2.30 (95%CI, 1.44-3.67),趋势检验P=0.000。而极高水平的Hsp60抗原(>1000ng/mL)和高水平的Hsp60抗体(>中位数, 38.42U/mL)同时出现时,个体发生CHD的风险显著增加到14.04 (95% CI, 3.11- 63.40),趋势有极显著性(P<0.0001)。当高水平的Hsp60抗原和抗体与吸烟、高血压及糖尿病共存时,与没有任何危险因素的个体相比,有此四个或以上危险因素的个体患CHD的风险急剧增加到38.61 (95% CI, 14.85-100.41, P trend =0.000)。对hsp60基因多态性与Hsp60抗原、抗体水平的研究结果显示:采用多因素协方差分析校正混杂因素后,CHD组和对照组hsp60基因的rs2340690、rs788016、rs2565163和rs2305560四个SNPs不同基因型之间的血浆Hsp60抗原、抗体水平均无显著性差异(P>0.05)。按性别分层后,对照人群的女性中,rs788016位点GG和AG基因型的Hsp60抗体水平与AA基因型的相比显著增高,P<0.05。本部分结果表明: CHD组的Hsp60抗原和抗体水平均显著高于对照组,两者都是CHD发病独立的危险因素,并且Hsp60抗体与CHD的严重程度密切相关。Hsp60抗原和抗体对CHD的发病具有联合作用;高水平的Hsp60抗原、抗体与吸烟、高血压和糖尿病对CHD的发病风险具有显著的累积作用。hsp60基因的rs2340690、rs788016、rs2565163和rs2305560四个SNPs位点的多态性对Hsp60抗原、抗体水平没有明显的影响。第二部分Hsp70抗体与冠心病的关系本部分主要选择417例冠状动脉造影阳性的CHD,以年龄±1?岁、性别1:1频率匹配417例对照人群,采用候选基因SNPs选择方法,并结合文献资料,共选取hsp70上的rs1008438、rs1043618和rs2227956三个SNPs,运用TaqMan技术进行基因分型,ELISA试剂盒测定血浆Hsp70抗体,以探讨Hsp70抗体与CHD, hsp70基因多态性与Hsp70抗体水平以及CHD的关系。对Hsp70抗体与CHD关系的研究结果显示:CHD组Hsp70抗体水平显著低于对照组[260.35(190.78-391.01) vs. 297.93(212.70-430.14) ug/ml, P=0.010],Hsp70抗体水平在MI [255.32(185.03-391.40)ug/ml]和UA [251.31(179.61-339.33)ug/ml]中比SA [295.56(220.12-434.17)ug/ml]明显降低,差异有显著性(P=0.014),但MI和UA患者中的Hsp70抗体水平接近,无显著性差异(P>0.05)。长期使用他汀类和/或阿司匹林对个体Hsp70抗体水平无显著影响(P>0.05)。多元logistic回归分析提示高水平Hsp70抗体的出现是CHD的保护因素(P = 0.019),与低水平Hsp70抗体(≤中位数,277.08ug/ml)的个体相比,高水平Hsp70抗体(>中位数,277.08ug/ml)的个体发生CHD的风险降低约40%。随着Hsp70抗体水平的升高,个体患CHD的风险下降,差异有极显著性(P for trend=0.002)。以低水平Hsp70抗体(<25th)为参考,高水平Hsp70抗体(≥50th或≥75th)的个体发生CHD的风险均降低约50%。有多支血管病变(≥2支病变)的患者比较1支血管病变的患者OR随Hsp70抗体水平的增加呈降低的趋势。对hsp70基因多态性与Hsp70抗体水平的研究结果显示:采用多因素协方差分析校正混杂因素后,CHD组中rs1043618位点CC基因型携带者Hsp70抗体水平值最低,为2.42±0.23,显著低于GG基因型携带者Hsp70抗体水平(2.47±0.26),差异有显著性,P=0.036;rs1008438位点CC基因型携带者Hsp70抗体水平值也最低,为2.41±0.24,显著低于AA基因型携带者Hsp70抗体水平(2.48±0.25),差异有显著性,P=0.019;而rs2227956位点各基因型携带者在CHD组Hsp70抗体水平无显著性差异,P>0.05。对照组中rs1043618和rs1008438位点各基因型携带者Hsp70抗体水平均无显著性差异,P>0.05;rs2227956位点CC基因型携带者Hsp70抗体水平最低,为2.37±0.28,与TT基因型携带者Hsp70抗体水平(2.49±0.24)相比,有显著性差异。对hsp70基因多态性与CHD的研究结果显示:hsp70基因的rs1043618位点,采用非条件Logistic回归分析,在未调整其它危险因素时,与GG基因型携带者相比,CC基因型携带者患CHD的危险性增加(OR=1.58, 95%CI=1.01-2.47, P=0.046);调整混杂因素后,得到一致的结果(OR=1.71, 95%CI=1.02-2.86, P =0.041)。调整其它因素后在rs1008438和rs2227956中均未见显著性差异(P>0.05)。分层分析结果显示:对于rs1043618位点,在年龄≤60岁、BMI≤25、吸烟和没有CHD家族史者中,与GG基因型携带者相比,CC基因型携带者患CHD的危险性显著增加(OR值分别为2.21、2.29、1.73和1.74,P值分别为0.044, 0.015, 0.048和P=0.038)。而rs1008438和rs2227956两个SNPs分层分析后,均未见各个基因携带者型与CHD危险度之间有显著性关联。hsp70基因单倍型分析结果显示:与频率最高的TAG单倍型相比,TAC单倍型患CHD的危险性显著增高(OR=2.70, 95%CI:1.44-5.04, P=0.002);而其它各单倍型与之相比患CHD的危险性无显著性差异(P>0.05)。本部分结果表明:高水平的Hsp70抗体是CHD发病的保护因素,并且联系着较低的CHD的严重程度。CHD组中的rs1043618位点CC基因型和rs1008438位点CC基因型与Hsp70抗体水平的降低相关联;对照组中rs2227956位点CC基因型Hsp70抗体水平显著性降低。hsp70基因上的rs1008438和rs2227956与患CHD的危险度之间没有显著性关联;而rs1043618位点的CC基因型和3个位点的TAC单倍型患CHD危险性显著性增高。第三部分急性心肌梗塞患者血浆Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体的动态研究前两部分的研究结果表明,Hsp60抗原、抗体以及Hsp70抗体在CHD的发病中发挥截然不同的危害或保护作用,那么,究竟Hsp60抗原、抗体以及Hsp70抗体在CHD的病理过程中是如何动态变化而发挥作用的,迄今尚未有文献报道。本部分研究依据WHO的AMI诊断标准,收集武钢医院心内科住院的AMI患者20例,分别测定AMI患者入院时、入院后第2、3和7天的心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myocardial band,CK-MB)和肌红蛋白(myoglobin)以及Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体,以探讨血浆Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体在AMI发病过程中的动态变化以及与心肌损伤标志物的关系。对Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体水平动态变化的研究结果显示:20例AMI患者中,可检出血浆Hsp60的人数在到达时、到达后第2天、第3天和第7天逐渐减少,分别为15人、13人、10人和8人。到达时的平均浓度为117.47ng/mL,到达后第2天达到峰值,其中有3人Hsp60水平超过了1000ng/mL,然后逐渐下降,均显著高于到达后的第7天(0.00ng/mL),P<0.05。20例AMI患者血浆Hsp60抗体水平在所有时间点都有检出,但没有显著性差异。血浆Hsp70抗体水平逐渐增高,到达后第7天与到达时以及发病后第2天相比显著增高,P<0.05。对心肌梗塞标志物动态变化的研究结果显示:AMI患者血清cTnI水平在入院后第2天达到峰值15.56 (2.96-23.09)ng/ml,然后逐渐下降,但第7天仍高于正常水平(0-0.4ng/ml),是正常上限的2.3倍。血清CK-MB动态的变化规律与cTnI相似,在入院后第2天达到峰值88.10 (32.45-219.02)ng/ml,随后逐渐下降,第7天恢复至正常水平。血清肌红蛋白也呈明显的动态变化,在入院时即达到峰值261.50(104.97-759.02)ng/ml,其后逐渐下降,第7天完全恢复至正常水平。对Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体与心肌梗塞标志物关系的研究结果显示:Hsp60抗原与cTnI和CK-MB都存在线性正相关关系,随着cTnI或CK-MB浓度不断的增高,Hsp60抗原水平也随之增加,有显著性意义,相关系数分别为r=0.391和r=0.205。而Hsp60抗体和Hsp70抗体与cTnI和CK-MB的相关关系没有显著性意义。Hsp70抗体和肌红蛋白呈现出线性负相关关系,随着肌红蛋白浓度不断的增高,Hsp70抗体水平随之下降,相关系数r=-0.230,P=0.040。Hsp60抗原和抗体与肌红蛋白则没有显著的相关关系。本部分结果表明:AMI患者血浆Hsp60在心梗后迅速释放,Hsp60与cTnI和CK-MB呈显著正相关,而且比cTnI和CK-MB增高出现的时间更早,提示血浆Hsp60出现高水平的时间以及动态变化可以作为早期临床判断AMI患者心肌损害的辅助指标。血浆Hsp70抗体水平在AMI后显著下降,以后逐渐增高,到达后第7天与到达时相比明显增高,有显著性差异,表明Hsp70抗体在CHD的急性发病阶段可能起着保护性作用。综上所述,本研究分析了Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体在CHD血浆中的表达水平,并且与其它CHD危险因素的联合作用,以及AMI患者血浆中Hsp60抗原、抗体和Hsp70抗体的动态变化可能与心肌损伤病理过程的关系,同时研究了hsp60和hsp70基因多态性对Hsp60抗原、抗体及Hsp70抗体水平的影响,以探讨它们在CHD发病机制中的生物学意义,结果表明:1、CHD组的Hsp60抗原和抗体水平均显著高于对照组,两者都是CHD发病独立的危险因素,并且Hsp60抗体与CHD的严重程度密切相关。2、Hsp60抗原和抗体对CHD的发病具有联合作用;高水平的Hsp60抗体与高血压、糖尿病同时出现时,个体患CHD的风险增加到20.99倍;高水平的Hsp60抗原和抗体与现在吸烟、高血压和糖尿病对CHD的发病具有显著的累积作用(OR=38.61)。3、hsp60基因的rs2340690、rs788016、rs2565163和rs2305560四个SNPs位点的多态性对血浆Hsp60抗原和抗体水平没有明显的影响。4、CHD组的Hsp70抗体水平显著低于对照组,MI和UA中的Hsp70抗体水平均显著低于SA。高水平的Hsp70抗体使个体发生CHD的风险降低,并且联系着较低的CHD的严重程度。5、CHD组hsp70基因上的rs1043618和rs1008438位点的CC基因型均与Hsp70抗体水平的降低相关联;对照组中rs2227956位点CC基因型Hsp70抗体水平显著性降低。hsp70基因上rs1043618位点的CC基因型患CHD危险性显著性增高。6、AMI患者血浆Hsp60在心梗后迅速释放,并且与cTnI和CK-MB呈显著正相关,充分证实了Hsp60在CHD中的有害作用。血浆Hsp70抗体水平在AMI后显著下降,以后逐渐增高,提示Hsp70抗体在CHD的急性发病阶段可能起着保护性作用。本研究的创新之处在于:1、选用了年龄和性别严格匹配的大样本病例-对照人群,首次探讨了血浆Hsp60抗原和抗体在CHD中的联合作用,以及与其它传统的CHD危险因素对CHD发病的累积效应。发现高水平的Hsp60抗原和抗体对CHD有显著的联合效应,当与其它危险因素同时出现时,个体发生CHD的风险急剧增加。2、首次探讨了hsp60和hsp70基因多态性对Hsp60抗原、抗体及Hsp70抗体水平的影响,发现CHD人群中rs1043618和rs1008438 SNPs位点的C等位基因联系着降低的Hsp70抗体水平,使得患CHD的风险增加,充分表明了遗传因素可以通过改变蛋白质的水平来影响疾病的易感性。3、采用前瞻性研究方法,首次探讨了Hsp60抗原、抗体及Hsp70抗体水平在AMI病理过程中不同时间点的动态变化,有效地阐明了Hsp抗原、抗体与AMI的因果关系,提供有力的证据解释了它们在CHD中免疫反应的角色进而导致血浆水平变化的原因。本研究有待深入的地方:1、病例对照研究难以确定Hsp抗原、抗体与CHD的因果关系,Hsp60抗原和抗体以及与其它CHD危险因素的联合作用有待在前瞻性大样本研究中验证。2、Hsp60抗原、抗体及Hsp70抗体水平在AMI中的动态研究样本量过小不能作出肯定性结论,有待在更大样本的前瞻性研究中进一步验证它们在AMI病理过程中的确切作用。3、由于技术上的原因,公司不能提供有效测定Hsp70抗原的方法,使得我们无法分析Hsp70抗原和抗体的关系,更进一步解释Hsp70抗体在CHD发病中的保护作用,此有待在血管内皮细胞中深入验证。4、进一步分析上述基因附近的SNPs和抗原、抗体的关系,以期发现基因多态性与蛋白质表达以及CHD危险度关联的可能机制。

全文目录

摘要  5-14
Abstract  14-25
全文缩写词  25-26
前言  26-30
第一部分 Hsp60 抗原、抗体与冠心病的关系  30-63
  1. 冠心病数据库建立及研究对象一般情况  30-33
  2. Hsp60 抗体与冠心病的关系  33-47
    2.1. Hsp60 抗体与冠心病发病与严重程度的关系  34-42
    2.2. Hsp60 抗体与高血压、糖尿病在冠心病中的联合作用  42-47
  3. Hsp60 抗原与冠心病的关系  47-56
    3.1. Hsp60 抗原与冠心病发病风险的关系  47-53
    3.2. Hsp60 抗原和抗体在冠心病发病中的联合作用  53-56
  4. hsp60 基因多态性和Hsp60 抗原、抗体水平的关系  56-63
第二部分 Hsp70 抗体及冠心病的关系  63-80
  1. 研究对象一般情况  63-66
  2. Hsp70 抗体与冠心病的关系  66-73
  3. hsp70 基因多态性与Hsp70 抗体水平及冠心病的关系  73-80
第三部分急性心肌梗塞患者血浆Hsp60 抗原、抗体和Hsp70 抗体的动态研究  80-92
  1. 研究对象一般情况  80-82
  2. Hsp60 抗原、抗体和Hsp70 抗体水平的动态变化  82-85
  3. 心肌梗塞标志物的动态变化  85-88
  4. Hsp60 抗原、抗体和Hsp70 抗体与心肌梗塞标志物的关系  88-92
结论  92-93
致谢  93-94
参考文献  94-122

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