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中华绒螯蟹（Eriocheir Sinensis）Peroxiredoxin 6和Thioredoxin 1基因的克隆及表达

作　者: 母昌考
导　师: 宋林生
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 水产养殖
关键词: 中华绒螯蟹 固有免疫 过氧化物还原酶 硫氧还蛋白 基因克隆 基因表达 菌刺激 抗氧化活力 过氧化物酶活力
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


中华绒螯蟹是我国重要的水产经济动物,近年来养殖规模不断扩大,产量持续增加。但是,伴随着养殖规模的扩大,养殖环境也日益恶化并导致了大量疾病的发生,严重制约了中华绒螯蟹养殖业的健康发展。因此,疾病预防和控制对中华绒螯蟹养殖业的可持续发展具有举足轻重的作用。与其他无脊椎动物一样,中华绒螯蟹的免疫系统没有免疫球蛋白和淋巴细胞,而是依靠由细胞免疫和体液免疫构成的固有免疫系统来对病原进行识别和清除。中华绒螯蟹的固有免疫机制的研究有助于推动中华绒螯蟹病害防治工作的开展。本研究采用大规模EST测序方法,结合末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从中华绒螯蟹血淋巴中克隆到了过氧化物还原酶(peroxiredoxin,EsPrx6)和硫氧还蛋白(thioredoxin,EsTrx1)基因的cDNA全长序列;采用实时荧光定量PCR技术检测了这两个基因在健康个体中表达的组织分布情况以及鳗弧菌刺激后血淋巴细胞中的时序表达规律;同时,将这两个基因的编码区克隆到pET系列载体,并在大肠杆菌中实现了重组表达,并进行了体外活性检测。过氧化物还原酶是一个抗氧化蛋白超家族,在保护机体免受活性氧(reactive oxygen species,ROS)的伤害中发挥着重要作用。中华绒螯蟹Prx6(EsPrx6)基因的cDNA全长为1076 bp,5` UTR(untranslated region,UTR)为69 bp,3` UTR为347 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为660 bp,编码219个氨基酸的蛋白。mRNA 3`-端具有多聚腺苷酸加尾信号(polyadenylation signal)AATAAA和polyA尾巴。EsPrx6的预测分子量为24 kDa,理论等电点为6.21,具有一个保守的Prx结构域、一个AhpC结构域和过氧化物酶催化活性中心PVCTTE,表明EsPrx6属于1-Cys型Prx。在所检测的组织中均有EsPrx6的表达,其中以肝胰腺表达量最高,为血淋巴细胞中表达量的17.4倍。鳗弧菌刺激后,血淋巴细胞中EsPrx6的表达下降,到12 h时,实验组显著低于对照组(P<0.05);随时间推移,表达水平逐渐回升,但在整个实验期间,都没有恢复到起始水平。将EsPrx6进行体外重组并在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中实现表达,重组EsPrx6具有预期的抗氧化活性和过氧化物酶活性,其中抗氧化活力为14.69 U/mg蛋白,高于相同条件下GSH的抗氧化力(P<0.05),过氧化物酶活力为23.46 U/mg蛋白。结果表明,EsPrx6作为一种重要的抗氧化剂,在中华绒螯蟹抵御ROS可能引起的氧化损伤方面具有重要作用。硫氧还蛋白是广泛存在于生物体内的一种具有硫醇依赖性的具有还原活性的蛋白。中华绒螯蟹Trx1(EsTrx1)基因的cDNA全长为641 bp,5` UTR为17 bp,3` UTR为306 bp,开放阅读框为318 bp,编码105个氨基酸。EsTrx1的预测分子量为12.2 kDa,理论等电点为4.8。EsTrx1不含信号肽,其氨基酸序列与其他动物的Trx1s具有高度相似性,如与地中海黄蝎的Trx1相似度达到73%;而与其他物种Trx2的同源性很低,相似度仅为14.3-22.8%,表明EsTrx1属于Trx1亚族。实时荧光定量PCR检测发现,EsTrx1在鳃、性腺、肝胰腺、肌肉、心脏和血淋巴细胞中都有表达。血淋巴细胞中EsTrx1 mRNA的表达量在菌刺激后上升,刺激后6 h,实验组表达量显著高于对照组和空白组(P<0.05),然后逐渐恢复到刺激前水平。为进一步探讨其生物学功能,将EsTrx1进行体外重组并在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)得到表达,重组EsTrx1具有预期的氧化还原调节活性,抗氧化活力为3.06 U/mg,且抗氧化活力高于GSH(P<0.05)。rEsTrx1的二硫键还原活力为5.03,低于凡纳滨对虾的二硫键还原活力(10.44),接近于大肠杆菌(4.93),小牛胸腺(6.50)和小牛肝脏(5.09),而高于鲍鱼Trx2(1.83)活力。结果表明,EsTrx1在生理条件下能够作为一种重要的抗氧化剂,参与对细菌感染的免疫应答反应。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 文献综述  12-36
  第一节 中华绒螯蟹病害研究现状  12-14
  第二节 无脊椎动物的免疫防御机制  14-22
    2.1 体液免疫  15-19
      2.1.1 黑化反应  15-16
      2.1.2 溶菌酶  16-17
      2.1.3 凝结系统  17-18
      2.1.4 抗菌肽  18-19
    2.2 细胞免疫  19-20
      2.2.1 吞噬作用  19-20
      2.2.2 包裹、杀灭和排除作用  20
      2.2.3 结节形成  20
    2.3 病原的识别和清除  20-22
  第三节 活性氧及氧化还原平衡  22-24
    3.1 活性氧的产生及作用  22-23
    3.2 氧化还原平衡  23
    3.3 生物体对ROS 的防御  23-24
  第四节 生物体中的酶抗氧化剂和非酶抗氧化剂  24-33
    4.1 细胞内的非酶抗氧化剂  25-27
      4.1.1 抗坏血酸  25
      4.1.2 还原型谷胱甘肽  25-26
      4.1.3 维生素E  26
      4.1.4 类胡萝卜素  26
      4.1.5 硫氧还蛋白  26-27
    4.2 细胞内的酶抗氧化剂  27-33
      4.2.1 超氧化物歧化酶  28-29
      4.2.2 过氧化氢酶  29
      4.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶  29-30
      4.2.4 过氧化物还原酶  30-33
  第五节 本研究的目的和意义  33-36
    5.1 本研究的目的  33
    5.2 本研究的意义  33-36
第二章 材料与方法  36-56
  第一节 实验材料及仪器设备  36-38
    1.1 主要化学试剂  36
    1.2 仪器设备  36-37
    1.3 实验材料及其处理  37
    1.4 溶液的配制  37-38
  第二节 实验方法  38-56
    2.1 实验用品的预处理  38
    2.2 中华绒螯蟹总RNA 的提取  38-39
    2.3 中华绒螯蟹cDNA 文库的构建  39
    2.4 序列分析与目的基因片段的获得  39-40
    2.5 中华绒螯蟹cDNA 的制备  40
    2.6 中华绒螯蟹Prx6 和Trx1 基因cDNA 全长序列的克隆  40-45
      2.6.1 引物设计及PCR 扩增条件  40-41
      2.6.2 3`RACE 扩增  41-42
      2.6.3 5` RACE 扩增  42-44
      2.6.4 PCR 产物的回收纯化  44-45
    2.7 感受态细胞的制备、连接及转化  45-46
      2.7.1 感受态细胞的制备  45
      2.7.2 连接  45
      2.7.3 转化  45-46
    2.8 序列比较与系统进化分析  46
    2.9 实时荧光定量PCR 法检测目的基因的表达  46-47
    2.10 EsPrx6 和EsTrx1 的重组表达  47-51
      2.10.1 EsPrx6 的重组表达  47-51
      2.10.2 EsTrx1 的重组表达  51
    2.11 重组蛋白的活性检测  51-56
      2.11.1 过氧化物酶活力的检测  52
      2.11.2 抗氧化活力测定  52-53
      2.11.3 二硫键还原活性的测定  53-56
第三章 实验结果  56-74
  第一节 中华绒螯蟹Prx6 的基因克隆及表达分析  56-65
    1.1 EsPrx6 基因全长cDNA序列的克隆  56
    1.2 EsPrx6 基因的核苷酸分析  56
    1.3 EsPrx6 的序列分析  56-57
    1.4 EsPrx6 的同源性分析  57-58
    1.5 Prx 基因的进化分析  58-61
    1.6 EsPrx6 基因的组织表达  61-62
    1.7 菌刺激后EsPrx6 基因表达的变化  62-63
    1.8 EsPrx6 重组体的构建及蛋白表达结果  63-64
    1.9 rEsPrx6 的活性检测结果  64-65
  第二节 中华绒螯蟹Trx1 基因的克隆及重组表达结果  65-74
    2.1 EsTrx1 基因全长cDNA序列的克隆  65
    2.2 EsTrx1 基因的核苷酸分析  65
    2.3 EsTrx1 的序列分析  65-66
    2.4 EsTrx1 的同源性分析  66-67
    2.5 EsTrx 的进化分析  67-69
    2.6 EsTrx1 基因表达的组织分布  69
    2.7 菌刺激后EsTrx1 基因表达的变化  69-70
    2.8 EsTrx1 重组质粒的构建及蛋白表达结果  70-72
    2.9 rEsTrx1 蛋白的活性  72-74
第四章 讨论  74-80
第五章 结论  80-82
参考文献  82-108
博士期间完成的论文  108-109
致谢  109

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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