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MGb2-Ag在结直肠癌的表达及预后研究

作　者: 安艳新
导　师: 赵青川；王新
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: MGb2-Ag 结直肠癌单克隆抗体预后生存分析免疫组织化学
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

【背景】近二十年来,本实验室一直致力于胃肠道肿瘤的早期诊断和治疗。MGb2是我室利用淋巴细胞杂交瘤技术自行制备的一株胃癌特异性单克隆抗体。前期大量研究证实,MGb2的抗原即MGb2-Ag对胃癌具有良好的诊断和预后判断价值。近期工作主要集中于MGb2-Ag的抗原鉴定上,利用我室蛋白组学的优势平台,初步鉴定MGb2-Ag为TRAK1,后续的验证及分子机制尚在进行中。MGb2-Ag在胃癌的发展过程中扮演着重要作用,但其在结直肠癌中的功能研究尚少,还需要进行系统深入的研究。【目的】1.检测MGb2-Ag是否在结直肠癌组织中表达。2.分析MGb2-Ag的表达是否与结直肠癌患者的总生存率相关。3.初步探索MGb2单抗对胃肠道肿瘤细胞生长有无抑制作用。【方法】1.收集140例结直肠癌临床组织样本,通过免疫组化法检测MGb2-Ag在其中的表达分布情况。2.通过非参数检验,分析MGb2的表达程度与病理分化、侵袭深度、有无转移等因素的相关性。3.通过临床随访(5年)和生存分析,筛选出影响患者总生存时间的相关因素。4.采用Western blot在结直肠癌组织和多个细胞系中检测MGb2-Ag的表达,初步确定目的条带及其表达模式。5.运用激光共聚焦显微镜观察MGb2-Ag的亚细胞定位。6.流式细胞仪检测MGb2单抗对AGS细胞凋亡的影响。【结果】1. MGb2-Ag在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常组织。140例结直肠癌组织标本中,MGb2-Ag的表达阳性率为86.71%。其中20例(14.29%)表达为阴性(-),60例(46.43%)表达为弱阳性(+), 40例(28.57%)表达为中等阳性(++),15例(10.71%)表达为强阳性(+++)。2. MGb2-Ag的表达与结直肠癌组织分化程度(p = 0.006)、浸润深度(p = 0.049)、临床病理分期(p = 0.032)具有显著相关性。但是并未发现MGb2-Ag的表达水平与病人的年龄、性别、淋巴结侵袭和远处转移具有显著相关性(p值分别为0.586、0.308、0.910和0.068)。3. Kaplan–Meier分析发现:MGb2-Ag表达程度越高,结直肠癌病人的总生存时间越短(log-rank检验:p<0.001)。结直肠癌患者的术后平均及中位生存时间分别为41.011±1.75个月、50个月。MGb2-Ag阴性表达的结直肠癌患者术后平均生存时间为48.7±3.934个月,而MGb2-Ag弱阳性、中等阳性以及强阳性表达的患者术后平均生存时间分别为44.57±2.19个月,34.76±2.8个月和19.53±4.24个月。通过单变量分析,MGb2-Ag过表达、肿瘤侵袭、远处转移以及临床病理分期与结直肠癌患者的生存时间显著相关。将单变量分析筛选的相关因素纳入Cox风险比例模型。以校正的MGb2-Ag阴性表达组(-) HR=1.00作为参考值,弱阳性组(+)、中度阳性组(++)和强阳性组(+++)的HR值分别为1.328 (p = 0.532),2.88 (p = 0.019)和6.7509 (p < 0.001)。单变量和多变量分析结果均提示MGb2-Ag过表达和肿瘤的分化程度是两个独立的预测结直肠癌预后的因素。4. Western blot结果显示,MGb2-Ag在结直肠癌组织和细胞中表达均高于正常对照,细胞系中尤以SW480为著。MGb2-Ag表达模式为两条蛋白带,分子量约为100kDa和120kDa。5. MGb2-Ag在胞浆和胞膜上均有表达,但主要定位于细胞膜上。6. MGb2单抗可诱导AGS细胞发生早期凋亡并且呈剂量依赖性。【结论】1.本研究率先观察了MGb2-Ag在结直肠癌中的表达分布情况,发现MGb2-Ag可以作为一个潜在的预测结直肠癌患者预后的重要分子标志物。2. MGb2-Ag在结直肠癌组织和细胞中高表达且两条蛋白带,与我们前期在胃癌中的发现较为一致。这提示MGb2-Ag在结直肠癌中可能发挥一定的作用。3.首次发现MGb2-Ag定位于细胞膜上,并且MGb2单抗可诱导AGS细胞发生早期凋亡。该部分结果有望为胃肠道特异性分子靶向药物的研发奠定基础。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
前言  15-17
文献回顾  17-22
  1.肿瘤间质  17
  2. 肿瘤细胞  17-19
  3. 死亡受体和配体  19
  4. 结直肠癌干细胞(CSC)  19-20
  5. 其它类分子  20
  6. 本实验室对胃肠道肿瘤作出的贡献  20-21
  7. MGb2-Ag 是否与结直肠癌存在相互联系  21-22
第一部分检测MGb2-Ag在结直肠癌中的表达情况  22-47
  1 主要的实验材料和仪器  22-24
    1.1 实验材料  22-23
    1.2 主要实验仪器  23-24
  2 方法  24-32
    2.1 有限稀释法将 MGb2 单克隆化  24-26
    2.2 MGb2 单克隆抗体的大量制备  26
    2.3 MGb2 单克隆抗体的纯化  26-27
    2.4 组织芯片制备  27
    2.5 免疫组织化学染色  27-28
    2.6 统计学分析  28-29
    2.7 细胞及新鲜组织样品的获得  29
    2.8 SDS-PAGE 和Western blot  29-30
    2.9 MGb2-Ag 的亚细胞定位  30-31
    2.10 流式细胞仪（FCM）检测MGb2 对细胞凋亡的影响  31-32
  3 结果  32-43
    3.1 单克隆化后获得具有较高分泌能力的MGb2 细胞株  32-33
    3.2 MGb2 单克隆抗体的大量制备  33-34
    3.3 纯化并验证MGb2 单克隆抗体活性  34-35
    3.4 成功制备结直肠癌组织芯片  35-36
    3.5 MGb2-Ag 在结直肠癌中的表达及与临床病理之间的关系  36-38
    3.6 生存分析  38-41
    3.7 Western blot 证实MGb2-Ag 在结直肠癌组织和细胞水平过表达  41
    3.8 MGb2-Ag 主要定位于结肠癌细胞膜上  41-42
    3.9 MGb2 单抗可诱导AGS 细胞发生凋亡  42-43
  4 讨论  43-47
    4.1 MGb2 优质单克隆抗体的获得  43-44
    4.2 MGb2-Ag 在结直肠癌组织的表达  44
    4.3 MGb2-Ag 可以作为预测结直肠癌预后的分子标志物  44-45
    4.3 MGb2-Ag 的亚细胞定位分析  45-46
    4.4 MGb2 对胃肠肿瘤直接作用的初步尝试  46-47
小结  47-48
参考文献  48-56
附录  56-58
  试验中常用工作液的配制方法  56-58
    1. Western blot 常用液体配方  56-57
    2. 胰酶消化液的配制  57-58
个人简历和研究成果  58-59
致谢  59-60

MGb2-Ag在结直肠癌的表达及预后研究

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