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人牙周炎症组织中干/祖细胞的体外分离、纯化及初步鉴定

作　者: 谈珺
导　师: 王勤涛；王新文
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 牙周炎人牙周膜干细胞间充质干细胞免疫细胞化学诱导分化
分类号: R781.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

牙周组织工程是使牙周组织缺损得到再生性修复的较理想和具有实用前景的方法,合理选择种子细胞是其获得成功的关键。目前牙周组织工程的种子细胞多选用干细胞,其来源多为健康的人体组织,通常存在取材有创、来源有限等弊端,在一定程度上限制了其应用于临床治疗的可行性。现阶段,治疗中、重度牙周炎最常用、最有效的方法仍是牙周手术,术中必不可少的一步就是尽可能地去除所有炎症肉芽、彻底清创。牙周炎症组织中,修复和破坏过程是共同存在并可互相转化的。肉芽组织的转归除了疤痕,还可能是再生组织,而组织再生离不开间充质干细胞。现已有实验分别在增生性龈炎的炎症牙龈组织和不可逆性牙髓炎患牙的炎症牙髓组织中发现了间充质干细胞,提示我们在炎症组织应该存在干细胞。另有研究发现,从牙周炎患牙的肉芽组织中能提取一种可向神经细胞分化的细胞,这进一步提示我们,牙周炎症肉芽组织中可能存在具多向分化能力的细胞。而牙周组织破坏发生后,残留牙周膜比健康牙周膜中聚集了更多的具有干细胞特性的细胞,这些细胞很可能会在牙周手术中与肉芽组织一同被刮除。因此,能否在牙周手术中就地取材,从牙周炎症组织中获得种子细胞成为我们的关注点。本研究首次从牙周炎症组织中分离干细胞,并对其可能存在的干细胞特性进行了探讨。研究目的:从人牙周炎症肉芽组织中分离培养出原代细胞,并对其生物学特性和体外诱导分化能力等进行初步的生物学鉴定,期待能为其成为牙周组织工程的种子细胞提供依据。研究方法:1、从牙周炎患者拔除的患牙根中1/3或根分叉处粘连肉芽组织取材,采用酶消化组织块法行细胞原代培养,经有限稀释法进行细胞纯化。同时分别取材因阻生或正畸需要而拔除的健康第三磨牙或前磨牙牙根中1/3部牙周膜、健康人骨髓,原代培养并纯化牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞作为对照。取第4代细胞进行后续实验。2、对三种细胞用MTT法绘制生长曲线,使用流式细胞仪检测细胞周期,将细胞接种平皿培养10天测定其克隆形成率,使用免疫荧光染色检测波形丝蛋白、CD146和STRO-1的表达。3、将三种细胞按一定密度分别均匀接种于24孔板,24h后分别换为成骨诱导液和成脂诱导液,常规换液,培养30d。分别行茜素红和油红O染色,观察矿化结节和脂滴形成情况。研究结果:1、从人牙周炎症组织中分离的原代细胞贴壁生长,经纯化后细胞体积略小,多呈短梭形,形态上与健康人牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞相比无明显差异。2、牙周炎症组织来源细胞的生长曲线呈倒“S”形,生长速度、细胞周期分析S期细胞百分比和克隆形成率低于健康牙周膜干细胞,高于骨髓间充质干细胞;波形丝蛋白、CD146和STRO-1均有阳性表达。3、牙周炎症组织来源细胞经成骨诱导和成脂诱导后,分别有矿化结节和脂滴形成,其成骨和成脂能力与健康牙周膜干细胞相当,明显低于骨髓间充质干细胞。结论:该实验初步证实了人牙周炎症组织中存在有干/祖细胞,具有间充质干细胞的一般特点,但与正常牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞又存在异质性。但其细胞类型是否为牙周膜干细胞,是否具有较强的牙周组织再生能力,从而运用于牙周组织工程之中,仍需要更深入的实验来验证。

全文目录

缩略语表  6-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-15
前言  15-16
文献回顾  16-32
  一、牙周炎症组织损伤愈合的特点  16-17
  二、牙周再生性治疗方法  17-22
  三、牙周组织工程种子细胞  22-30
  四、牙周炎症组织存在干/祖细胞的可能性  30-32
实验一人牙周炎症组织中干/祖细胞的体外分离及纯化  32-40
  1 材料  33
  2 方法  33-35
    2.1 细胞原代培养  33-34
    2.2 细胞纯化  34-35
  3 结果  35-37
    3.1 原代细胞生长情况  35-36
    3.2 细胞纯化情况  36-37
  4 讨论  37-40
实验二人牙周炎症组织中干/祖细胞生物学特性的检测  40-48
  1 材料  40-41
  2 方法  41-43
    2.1 细胞生长曲线绘制  41
    2.2 克隆形成率测定  41-42
    2.3 细胞周期检测  42
    2.4 细胞表面抗原检测  42-43
  3 结果  43-45
    3.1 细胞生长曲线  43
    3.2 克隆形成率  43
    3.3 细胞周期  43-44
    3.4 表面抗原表达  44-45
  4 讨论  45-48
实验三人牙周炎症组织中干/祖细胞多向分化能力的检测  48-55
  1 材料  48-49
  2 方法  49-50
    2.1 成骨诱导  49
    2.2 成脂诱导  49-50
    2.3 统计学计算  50
  3 结果  50-52
    3.1 成骨诱导  50
    3.2 成脂诱导  50
    3.3 成骨成脂能力比较  50-52
  4 讨论  52-55
小结  55-56
参考文献  56-71
附录  71-76
个人简历和研究成果  76-77
致谢  77-78

人牙周炎症组织中干/祖细胞的体外分离、纯化及初步鉴定

内容摘要

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