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黑翅土白蚁体内纤维素酶编码基因的克隆与表达

作　者: 陈春润
导　师: 莫建初
学　校: 浙江大学
专　业: 环境生物学
关键词: 黑翅土白蚁纤维素酶内切-β-1 4-葡聚糖酶 β-葡萄糖苷酶
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

在纤维素降解过程中,至少需要内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-P-1,4-glucanase, EG, EC 3.2.1.4)、外切-β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase, CBH, EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BG, EC 3.2.1.21)三种成分的共同作用,但白蚁的内源性纤维素酶只包括内切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶两种成分,这两种成分由唾液腺和中肠上皮细胞分泌产生。低等白蚁后肠富含细菌、原生动物等共生微生物,它们分泌产生的纤维素酶,与白蚁内源性纤维素酶一道共同完成食物中纤维素类物质的降解。高等白蚁后肠缺乏原生动物,但其巢体上的共生真菌具丰富的纤维素酶,因此白蚁通常通过取食巢体上的共生真菌来获得外源性纤维素酶,协助完成食物中纤维素的消化与吸收。本文利用分子生物学手段对黑翅土白蚁内源性纤维素酶进行了初步的研究,从其体内克隆到了两个纤维素酶基因,利用异源表达系统对其进行了表达,并对其性质进行了初步研究,为今后进一步研究白蚁分解纤维素机理及更好的利用白蚁纤维素酶奠定了基础。1纤维素酶基因的克隆利用5’和3’RACE方法从黑翅土白蚁体内克隆到了两个纤维素酶基因的全长cDNA序列,并将其推导氨基酸序列与NCBI数据库中的其它白蚁的纤维素酶氨基酸序列进行了比对,发现内切-β-1,4-葡聚糖酶的同源性在75%以上,β-葡萄糖苷酶的同源性在52%以上。2纤维素酶基因在大肠杆菌中的表达利用pET-28a载体构建原核表达载体,将纤维素酶基因在大肠杆菌中进行诱导表达。结果发现在45-66.2kDa之间出现特异性条带,利用抗His标签单克隆抗体进行Western blot分析,证实成功地表达了目的蛋白。但是,对表达产物进行酶活测定后发现,原核表达产物没有纤维素酶活性。3纤维素酶基因在昆虫细胞中的表达利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统将目的基因在昆虫细胞中进行了表达,并利用制备的多克隆抗体进行Western blot分析,证实目的蛋白在昆虫细胞中成功表达。对表达产物的粗酶液进行酶活测定,结果显示重组内切-β-1,4-葡聚糖酶的酶活为0.190U,重组p-葡萄糖苷酶的酶活为0.117U。4黑翅土白蚁体内纤维素酶的性质分析通过半定量RT-PCR和Western blot的方法检测了纤维素酶在不同品级白蚁和不同组织间的表达情况和分布情况,并对不同品级白蚁和不同组织的纤维素酶活性进行了初步测定。结果显示：两种纤维素酶由唾液腺和中肠上皮细胞分泌产生,且这两个部位的纤维素酶活性最高。

全文目录

致谢  7-11
摘要  11-13
Abstract  13-15
1 引言  15-29
  1.1 纤维素酶的概述  15-23
    1.1.1 纤维素酶的组成  15
    1.1.2 纤维素酶的作用机理  15-16
      1.1.2.1 C_1-C_x假说  15
      1.1.2.2 顺序作用假说  15-16
      1.1.2.3 协同作用假说  16
    1.1.3. 纤维素酶的来源  16-18
      1.1.3.1 产纤维素酶的微生物  16-17
      1.1.3.2 产纤维素酶的动物  17-18
      1.1.3.3 产纤维素酶的植物  18
    1.1.4 纤维素酶的应用  18-23
      1.1.4.1 食品工业中的应用  18-20
        1.1.4.1.1 水果与蔬菜加工  18-19
        1.1.4.1.2 酒类生产  19
        1.1.4.1.3 酱油酿造  19-20
      1.1.4.2 饲料工业中的应用  20
      1.1.4.3 洗涤剂工业中的应用  20-21
      1.1.4.4 纺织工业中的应用  21
      1.1.4.5 造纸工业中的应用  21-22
      1.1.4.6 能源工业中的应用  22
      1.1.4.7 其他领域中的应用  22-23
  1.2 白蚁纤维素酶概况  23-27
    1.2.1 白蚁的分类  23-25
    1.2.2 白蚁纤维素酶的来源  25-27
      1.2.2.1 白蚁体内的共生鞭毛虫  25-26
      1.2.2.2 白蚁体内的共生细菌  26
      1.2.2.3 白蚁体外共生的真菌  26-27
      1.2.2.4 白蚁自身分泌产生  27
  1.3 本论文研究的目的和意义  27-29
2 纤维素酶基因的克隆  29-52
  2.1 材料与方法  29-37
    2.1.1 白蚁  29-30
    2.1.2 工具酶与试剂  30
    2.1.3 仪器  30
    2.1.4 培养基与溶液配制  30
    2.1.5 总RNA提取  30-31
    2.1.6 第一链cDNA的合成  31-32
    2.1.7 引物设计与纤维素酶基因cDNA片段的扩增  32-34
    2.1.8 5'-RACE  34-36
    2.1.9 3'-RACE  36-37
  2.2 结果  37-51
    2.2.1 总RNA的提取  37-38
    2.2.2 黑翅土白蚁纤维素酶基因cDNA片段的克隆  38-40
      2.2.2.1 内切-β-1,4-葡聚糖酶基因cDNA片段的克隆  38-39
      2.2.2.2 β-葡萄糖苷酶基因cDNA片段的克隆  39-40
    2.2.3 黑翅土白蚁纤维素酶基因cDNA末端克隆  40-42
      2.2.3.1 内切-β-1,4-葡聚糖酶基因cDNA末端克隆  40-41
      2.2.3.2 β-葡萄糖苷酶基因cDNA末端克隆  41-42
    2.2.4 黑翅土白蚁纤维素酶基因cDNA序列分析  42-47
      2.2.4.1 内切-β-1,4-葡聚糖酶基因cDNA序列分析  42-45
      2.2.4.2 β-葡萄糖苷酶基因cDNA序列分析  45-47
    2.2.5 黑翅土白蚁纤维素酶与其它白蚁纤维素酶的比较分析  47-51
      2.2.5.1 内切-β-1,4-葡聚糖酶的比较分析  47-49
      2.2.5.2 β-葡萄糖苷酶的比较分析  49-51
  2.3 讨论  51-52
3 纤维素酶基因在大肠杆菌中的表达  52-64
  3.1 材料与方法  52-60
    3.1.1 菌株与载体  52
    3.1.2 工具酶与试剂  52-53
    3.1.3 仪器  53
    3.1.4 培养基和溶液配制  53-54
    3.1.5 原核表达载体的构建  54-56
    3.1.6 诱导表达  56
    3.1.7 SDS-PAGE电泳  56-57
    3.1.8 Western Blot  57-58
    3.1.9 多克隆抗体制备  58-59
    3.1.10 酶活测定  59-60
  3.2 结果  60-63
    3.2.1 表达载体构建  60-61
    3.2.2 在大肠杆菌中的表达  61
    3.2.3 SDS-PAGE及Western blot分析  61-63
  3.3 讨论  63-64
4 纤维素酶基因在昆虫细胞中的表达  64-74
  4.1 材料与方法  64-69
    4.1.1 菌株与载体  64
    4.1.2 工具酶与试剂  64-65
    4.1.3 仪器  65
    4.1.4 真核表达载体的构建  65-66
    4.1.5 重组病毒的构建  66-67
    4.1.6 昆虫细胞的转染  67-68
    4.1.7 SDS-PAGE电泳  68
    4.1.8 Western blot  68-69
    4.1.9 酶活测定  69
  4.2 结果  69-73
    4.2.1 表达载体构建  69-70
    4.2.2 在昆虫细胞中的表达  70-71
    4.2.3 SDS-PAGE及Western blot分析  71-73
  4.3 讨论  73-74
5 黑翅土白蚁体内纤维素酶的性质分析  74-84
  5.1 材料与方法  74-76
    5.1.1 白蚁  74
    5.1.2 工具酶与试剂  74
    5.1.3 仪器  74-75
    5.1.4 白蚁体内纤维素酶基因的表达水平  75
    5.1.5 白蚁体内纤维素酶的分布  75-76
    5.1.6 白蚁体内纤维素酶的酶活  76
  5.2 结果  76-82
    5.2.1 白蚁体内纤维素酶基因的表达水平  76-78
    5.2.2 白蚁体内纤维素酶的分布  78-80
    5.2.3 白蚁体内纤维素酶的活性  80-82
  5.3 讨论  82-84
6 总结  84-85
不足之处及今后研究方向  85-86
参考文献  86-90
攻读博士学位期间的研究成果  90-91

黑翅土白蚁体内纤维素酶编码基因的克隆与表达

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