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运动发酵单胞菌工程菌株的构建及发酵的初步研究

作　者: 李锡敏
导　师: 郭安平
学　校: 海南大学
专　业: 农业生物技术
关键词: 瑞氏木霉内切葡聚糖酶 泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶 木薯 酒精 发酵 Zymomonas mobilis
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


20世纪,科学家利用石油作为主要能源及石油化学品的原料,为人类社会发展做出了巨大的贡献。但随之也出现了两个严重的问题：一是石油为不可再生的资源。二是用石油作为燃料及化学品原料使环境遭到严重破坏,特别是CO2的温室效应。随着人们对全球性能源危机认识的不断加深及环境保护意识的不断加强,研究与寻找环境友好的石油能源的替代品成为世界技术开发的方向之一。从20世纪70年代中期开始,利用生物技术和可再生资源(生物源)进行乙醇的工业化生产,并以此作为石油能源的替代物成为各国的研究热点。运动发酵单胞菌是极具开发潜力的乙醇生产菌种,与传统的发酵乙醇的微生物如酿酒酵母相比,运动发酵单胞菌具有很多优点,但其可利用的底物仅为葡萄糖、果糖和蔗糖。为了开发利用运动发酵单胞菌卓越的产乙醇能力,应用基因工程手段扩大运动发酵单胞菌的底物范围,使其能够同时利用淀粉与纤维素生产乙醇,是实验的最终目的。本研究首先提取Z.mobilis ATCC31821总基因组DNA,进行引物设计(Jeong-Sun Seo et al.2005, GenBank Accession 008692.2),从细菌中克隆出丙酮酸脱羧酶(pdc)启动子pdc。以酵母表达载体pPIC9K为模板,进行引物设计(Scorer,C.A.,1994, GenBank:Z46234.1),用PCR的方法克隆出一段约为270bp的片段,即信号肽α-mating factor。提取瑞氏木霉总RNA,做RT-PCR,克隆出内切葡聚糖酶基因。提取泡盛曲霉总RNA,做RT-PCR,克隆出葡萄糖淀粉酶基因。将启动子pdc,信号肽,内切葡聚糖酶基因和葡萄糖淀粉酶基因克隆到pBBR1-MCS2表达载体上,构建了两个单价载体-BPSG, pBPSE和一个双价载体pBPSGE。将这三个表达载体分别转化Z. mobilis ATCC31S21,得到重组菌Z.mobilis ATCC31821 (pBPSG), Z.mobilis ATCC31821 (pBPSE)和Zmobilis ATCC31821(pBPSGE)。30℃培养,测其酶活分别为0.94U/ml、0.76U/ml、1.57U/ml, Z.mobilis、Z.mobilis (pBBR1-MCS2)没有检测到酶活性。用Z.mobilis、Z.mobilis (pBBR1-MCS2)、Z.mobilis ATCC31821 (pBPSG), Z.mobilis ATCC31821 (pBPSE)和Z. mobilis ATCC31821 (pBPSGE)发酵木薯粉。48h后运动发酵单胞菌的酒精产率达到最大值,Z.mobilis ATCC31821产量9.05°,Z.mobilis ATCC31821 (pBBR1-MCS2)产量9.02°, Z.mobilis ATCC31821 (pBPSG)产量9.34°,Z.mobilis ATCC31821 (pBPSE)产量9.46°,Z.mobilis ATCC31821(pBPSGE)产量9.71°。由结果可见,重组菌酒精产量明显比野生菌高。本研究旨在构建能够直接利用淀粉与纤维素的运动发酵单胞菌,使其能够利用木薯粉发酵生产酒精。因此要在运动发酵单胞菌中转入能够分解纤维素和淀粉的内切葡聚糖酶基因和葡萄糖淀粉酶基因,使其能够直接利用淀粉与纤维素发酵生产酒精。本研究也为以后构建产醇量更高的运动发酵单胞菌工程菌菌株打下基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章:文献综述  12-30
  1.1 燃料乙醇  12-15
    1.1.1 世界燃料乙醇产业概况  12-13
    1.1.2 我国乙醇产业的现状  13-14
    1.1.3 燃料乙醇的原料来源  14
      1.1.3.1 粮食类作物  14
      1.1.3.2 经济类作物  14
      1.1.3.3 纤维素类  14
    1.1.4 世界燃料乙醇的技术进展  14-15
    1.1.5 燃料乙醇与环境  15
  1.2 运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis  15-18
    1.2.1 Zymomonas mobilis的介绍  15-16
    1.2.2 菌种的遗传工程的改良  16-18
  1.3 葡萄糖淀粉酶  18-20
    1.3.1 葡萄糖淀粉酶简介  18-19
    1.3.2 泡盛曲霉简介  19-20
  1.4 纤维素酶  20-23
    1.4.1 纤维素酶简介  20-21
    1.4.2 纤维素酶的应用  21-22
    1.4.3 纤维素酶的前景  22-23
    1.4.4 瑞氏木酶内切葡聚糖酶  23
  1.5 木薯  23-28
    1.5.1 木薯的起源及分布  23-24
    1.5.2 木薯的生物学特性  24-25
    1.5.3 木薯的经济价值及用途  25-28
      1.5.3.1 作为粮食作物  25-26
      1.5.3.2 作为优质饲料  26
      1.5.3.3 作为工业原料  26-27
      1.5.3.4 作为生物质能源  27-28
  1.6 本课题的研究目的及研究内容  28
    1.6.1 研究目的  28
    1.6.2 研究意义  28
    1.6.3 研究内容  28
  1.7 本研究的技术路线  28-30
第二章:实验材料与方法  30-50
  2.1 实验材料  30-35
    2.1.1 菌株与质粒  30
    2.1.2 主要试剂  30-31
    2.1.3 培养基  31
    2.1.4 酶活力测定试剂的配制  31-32
    2.1.5 DNS(二硝基水杨酸)法测定酶活力所需试剂的配制  32-33
    2.1.6 SDS-PAGE所需试剂的配制  33
    2.1.7 木薯发酵所需试剂的配制  33-34
    2.1.8 酒精含量测定所需试剂的配制  34
    2.1.9 设备和仪器  34-35
  2.2 实验方法与步骤  35-50
    2.2.1 Z.mobilis的培养  35-36
      2.2.1.1 菌种的活化和保存  35
      2.2.1.2 Z.mobilis的培养条件  35
      2.2.1.3 Z.mobilis ATCC31821感受态细胞的制备  35-36
    2.2.2 基因操作  36-38
      2.2.2.1 Z.mobilis ATCC31821基因组DNA的提取  36-37
      2.2.2.2 Trichoderma viride AS3.3711和Aspergillus awamori AS3.2783总  37
      RNA的提取  37-38
    2.2.3 引物的设计与合成  38
    2.2.4 PCR反应体系  38-40
      2.2.4.1 RT-PCR反应体系  38-39
      2.2.4.2 High Fidelity PCR Enzyme Mix反应体系  39
      2.2.4.3 PCR反应条件  39-40
    2.2.5 酶切反应  40
    2.2.6 DNA琼脂糖凝胶电泳及其DNA片段回收  40-41
    2.2.7 连接反应体系  41
    2.2.8 感受态的制备  41-43
      2.2.8.1 大肠杆菌感受态的制备  42
      2.2.8.2 Z.mobilis ATCC31821感受态细胞的制备  42-43
    2.2.9 转化  43-44
      2.2.9.1 大肠杆菌转化方法  43
      2.2.9.2 Z.mobilis的电转化方法  43-44
      2.2.9.3 重组质粒在Z.mobilis内的稳定性检测  44
    2.2.10 质粒的提取  44-45
    2.2.11 粗酶夜的制备  45-46
      2.2.11.1 超声波处理菌体,制备粗酶液  45
      2.2.11.2 冷冻干燥浓缩法制备粗酶夜  45-46
    2.2.12 DNS法测定还原糖  46-47
      2.2.12.1 测定原理  46
      2.2.12.2 葡萄糖标准曲线的制备  46-47
    2.2.13 酶活力的测定  47
      2.2.13.1 内切葡聚糖酶(EGⅢ)活力测定  47
      2.2.13.2 葡萄糖淀粉酶(GA Ⅰ)活力测定  47
      2.2.13.3 酶活计算  47
    2.2.14 木薯粉发酵  47-48
      2.2.14.1 木薯粉中淀粉含量的测定  48
      2.2.14.2 液化  48
      2.2.14.3 糖化  48
      2.2.14.4 接种  48
      2.2.14.5 发酵  48
    2.2.15 发酵液中酒精的蒸馏  48
    2.2.16 发酵后残渣中淀粉含量的测定  48
    2.2.17 发酵液中酒精含量的测定  48-50
      2.2.17.1 测定原理  48-49
      2.2.17.2 实验方法  49
      2.2.17.3 计算  49-50
第三章:实验结果与讨论  50-73
  3.1 基因的克隆  50-59
    3.1.1 Z mobilis ATCC31821 pdc启动子的克隆  50-51
      3.1.1.1 Z.mobilis ATCC31821基因组DNA的提取与转录PCR  50
      3.1.1.2 基因序列的测定  50-51
    3.1.2 信号肽的克隆  51-52
    3.1.3 启动子和信号肽的串联  52
    3.1.4 瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因的克隆  52-55
      3.1.4.1 瑞氏木霉总RNA的提取与反转录PCR  52-53
      3.1.4.2 转化克隆的鉴定与测序  53-54
      3.1.4.3 瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因EGⅢ的分析  54-55
    3.1.5 启动子、信号肽和内切葡聚糖酶基因EGⅢ的克隆  55
    3.1.6 泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆  55-59
      3.1.6.1 泡盛曲霉总RNA的提取与反转录PCR  56
      3.1.6.2 转化克隆的鉴定与测序  56-57
      3.1.6.3 泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶基因GA Ⅰ的分析  57-59
    3.1.7 葡萄糖淀粉酶基因和终止子的克隆  59
  3.2 表达载体的构建  59-63
    3.2.1 表达载体的构建流程  59-60
    3.2.2 表达载体的构建  60-63
      3.2.2.1 表达载体pBPSG的构建与鉴定  60-61
      3.2.2.2 表达载体pBPSE的构建与鉴定  61-62
      3.2.2.3 表达载体pBPSGE的构建与鉴定  62-63
  3.3 内切葡聚糖酶基因和葡萄糖淀粉酶基因在运动发酵单胞菌中的表达  63-65
    3.3.1 pBPSG,pBPSE,pBPSGE转化Z.mobilis ATCC31821及转化子的鉴定  63-64
    3.3.2 Z.mobilis ATCC31821转化子表达蛋白SDS-PAGE电泳分析  64-65
  3.4 酶活最适温度的测定  65-67
  3.5 酶活最适pH的测定  67-68
  3.6 酶活力的测定  68
  3.7 木薯粉中淀粉的含量  68-69
  3.8 木薯发酵酒精含量的测定  69
  3.9 讨论  69-73
    3.9.1 内切葡聚糖酶和葡萄糖淀粉酶的选择  69-70
    3.9.2 表达载体的选择  70
    3.9.3 菌株的选择  70
    3.9.4 表达蛋白的酶活  70-71
    3.9.5 重组Z.mobilis的发酵  71
    3.9.6 本研究的后续工作  71-73
第四章:结论  73-74
参考文献  74-83
缩略词  83-84
致谢  84

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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