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黄芩素与β-内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的协同抗菌作用研究

作　者: 彭青
导　师: 钱元恕
学　校: 汕头大学
专　业: 药理学
关键词: 黄芩素 协同抗菌作用 自溶酶 苯唑西林 β-内酰胺酶 耐药菌 耐万古霉素 methicillin 细菌耐药 敏感性 微量稀释法 最低抑菌浓度 耐药率 Staphylococcus 琼脂稀释法 实验结果 菌体 抗生素选择 青霉素结合蛋白 多重耐药
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


一、MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)耐药表型和SCCmec基因分型目的了解汕头大学医学院附属第一医院分离的92株MRSA的耐药情况及其SCCmec基因型。方法1.提取细菌的基因组DNA,用聚合酶链反应(PCR)扩增MRSA携带的mecA基因,鉴定MRSA菌株2.琼脂稀释法测定16种抗菌药物对MRSA的最低抑菌浓度(MIC)。3.多重PCR扩增检测MRSA的SCCmec分子分型。结果1.92株MRSA均携带mecA基因。2. 92株MRSA对实验中所有β-内酰胺类抗生素的耐药率均在80%以上。绝大部分菌株对庆大霉素、红霉素、氟喹诺酮类也不敏感。超过半数的MRSA菌株对利福平保持敏感,对氯霉素,多西环素及米诺环素也普遍敏感,未发现耐万古霉素的MRSA菌株。3.临床分离株中以SCCmec III和IIIA型为主,该结果与亚洲多数国家分离的MRSA的SCCmec分型一致。结论1.我院第一附属医院的MRSA呈多重耐药,但对氯霉素,半合成四环素及万古霉素仍然敏感。2.临床分离株中以SCCmec III和IIIA型为主,说明HA-MRSA为该院的主要流行菌株。二、黄芩素与β-内酰胺类抗生素对MRSA的协同抗菌作用机制研究目的探讨黄芩素与β-内酰胺类抗生素合用对MRSA的协同抗菌作用机制。方法1.以微量稀释法测定单用黄芩素的最低抑菌浓度(MIC),并以微量棋盘稀释法测定黄芩素与β-内酰胺类抗生素的协同抗菌作用。2.应用AFFX原核表达谱芯片测定黄芩素对MRSA全基因组表达影响,Real-time PCR验证基因芯片结果。3.蛋白印迹法(Western-blot)检测黄芩素对PBP2a的表达的影响,采用荧光凝胶成像技术检测黄芩素对青霉素结合蛋白的作用。4.高效液相色谱法检测黄芩素对头孢唑啉在MRSA菌体内摄取浓度的影响。5.提取自溶酶粗提液和细胞壁粗提物,用SDS-PAGE凝胶电泳检测黄芩素对MRSA自溶酶谱及活性的影响。6.酶标仪检测黄芩素对β-内酰胺酶活性的抑制作用。结果1.单用黄芩素的MIC值在64-128μg/ml之间, 32μg/ml的黄芩素能使MRSA及ATCC 25923对苯唑西林,头孢唑啉及氨苄西林的敏感性增高,FIC(The fractional inhibitory concentration)指数在0.266到0.75之间,结果显示,32μg/ml黄芩素与苯唑西林,头孢唑啉与氨苄西林合用对MRSA有协同抗菌作用。2.基因芯片实验结果显示,黄芩素使164个基因表达上调,其中功能明确的基因有53个,332个基因表达下调,功能明确的基因有64个。这些基因主要包括基础代谢有关基因,转运子基因,转录调控有关的基因,DNA复制及修复,细菌自溶酶以及甲基化酶基因等。经Real-time PCR验证,结果与基因芯片结果相符。3. Western-blot结果显示:黄芩素单用或与苯唑西林合用并未能使MRSA所产的PBP2a表达显著下降。荧光凝胶成像结果显示:黄芩素不能诱导PBPs的表达增加,也未能显著影响各PBPs蛋白与Bocillin-FL的亲和力。4.黄芩素能使头孢唑啉在MRSA的菌体内的蓄积浓度显著增加。5.黄芩素能使MRSA的自溶酶表达增加,或能使自溶酶水解细胞壁的活性增强。6.黄芩素对MRSA所产的β-内酰胺酶的活性没有显著抑制作用。结论黄芩素与β-内酰胺类抗生素对MRSA有协同抗菌作用,能显著降低β-内酰胺类抗生素的最低抑菌浓度。黄芩素逆转MRSA的作用机制可能与以下几个方面有关:1.黄芩素能抑制耐药泵的表达,这一作用可使β-内酰胺类抗生素在菌体的摄取浓度增高,增加MRSA对抗生素的敏感性的作用;2.黄芩素干扰了DNA的复制和修复,增加了抗生素对MRSA的毒性作用;3.黄芩素通过影响某些甲基化酶及核糖体蛋白的表达,阻碍了正常的蛋白质合成过程;4.黄芩素能诱导MRSA的自溶酶系统,使MRSA对抗生素的敏感性增加。

全文目录


中文摘要  3-7
ABSTRACT  7-14
第一章 前言  14-17
第二章 MRSA耐药表型和SCCmec基因分型  17-40
  1. 材料  17-19
    1.1 菌株来源  17-18
      1.1.1 实验菌株  17
      1.1.2 质控菌株  17-18
      1.1.3 阳性对照菌  18
    1.2 试剂  18-19
      1.2.1 细菌培养基  18
      1.2.2 抗生素  18
      1.2.3 引物和PCR试剂  18-19
    1.3 仪器  19
  2. 方法  19-25
    2.1 试剂的配制  19-20
      2.1.1 MH肉汤配制  19-20
      2.1.2 TE缓冲液  20
      2.1.3 TAE电泳缓冲液  20
      2.1.4 溴化乙锭（EB）贮存液  20
    2.2 PCR扩增mecA基因鉴定MRSA  20-22
      2.2.1 基因DNA模板的提取  20-22
      2.2.2 PCR扩增mecA基因  22
    2.3 最低抑菌浓度测定（MIC）  22-24
      2.3.1 抗菌药物的配制  22
      2.3.2 含药琼脂的制备  22-23
      2.3.3 菌悬液的制备  23
      2.3.4 接种  23-24
    2.4 多重PCR扩增检测SCCmec分子分型  24-25
      2.4.1 多重PCR反应体系及条件  24
      2.4.2 琼脂糖电泳  24-25
  3. 结果  25-28
    3.1 MRSA的菌株鉴定  25-26
    3.2 抗生素对MRSA的MIC值及耐药率  26
    3.3 92 株MRSA的SCCmec 分型  26-28
  4. 讨论  28-34
  参考文献  34-40
第三章 黄芩素与β-内酰胺类抗生素对MRSA的协同抗菌作用机制研究  40-94
  1. 材料  40-42
    1.1 菌株来源  40-41
      1.1.1 实验菌株  40-41
    1.2 试剂  41
    1.3 仪器  41-42
  2. 方法  42-62
    2.1.微量稀释法测定单用黄芩素的最低抑菌浓度（MIC）  42-43
      2.1.1 细菌准备  42
      2.1.2 黄芩素溶液的配制  42-43
      2.1.3 黄芩素的 MIC 值测定  43
    2.2 微量棋盘稀释法测定黄芩素与β-内酰胺类抗生素的协同抗菌作用  43-44
    2.3 AFFX原核表达谱芯片测定黄芩素对MRSA全基因组表达影响  44-50
      2.3.1 样品的准备  44
      2.3.2 RNA的提取  44-45
      2.3.3 样品总RNA质量及完整性检测  45
      2.3.4 RNA反转录为cDNA  45-47
      2.3.5 cDNA纯化、定量  47
      2.3.6 cDNA片段化  47-48
      2.3.7 末端标记  48-49
      2.3.8 金黄色葡萄球菌基因芯片杂交  49
      2.3.9 芯片清洗染色与扫描  49-50
    2.4 Real-time PCR验证基因芯片结果  50-52
    2.5 黄芩素对PBP2a蛋白表达的影响  52-58
      2.5.1 主要试剂的配制  52-56
      2.5.2 MRSA总蛋白的抽提  56-57
      2.5.3 蛋白印迹法（Western-blot）检测PBP2a的表达变化  57
      2.5.4 荧光凝胶成像检测黄芩素对青霉素结合蛋白的影响  57-58
    2.6 高效液相色谱法（HPLC）测定黄芩素对金葡菌摄取头孢唑啉的影响  58-60
      2.6.1 色谱条件  58
      2.6.2 配制液体  58-59
      2.6.3 样品处理  59-60
      2.6.4 标准曲线制作  60
      2.6.5 回收率测定  60
      2.6.6 精密度测定  60
    2.7 黄芩素对MRSA自溶酶谱及活性的影响  60-61
      2.7.1 自溶酶谱及活性分析  60-61
    2.8 黄芩素对金葡菌β-内酰胺酶活性的影响  61-62
      2.8.1 配制nitrocefin溶液  61
      2.8.2 β-内酰胺酶的制备  61-62
      2.8.3 比较黄芩素和三唑巴坦对β-内酰胺酶的抑制作用  62
  3. 结果  62-79
    3.1 黄芩素与β-内酰胺类抗生素的协同抗菌作用  62-65
    3.2 基因芯片检测黄芩素对MRSA全基因组表达影响  65-72
      3.2.1 样品总RNA质量及完整性检测结果  65
      3.2.2 差异表达基因分析结果  65-72
    3.3 Real-time PCR（RT-PCR）验证基因芯片结果  72-73
    3.4 蛋白印迹法（Western-blot）检测PBP2a的表达变化  73-74
    3.5 荧光凝胶成像检测黄芩素对PBPs的表达及活性的影响  74-75
    3.6 HPLC测定黄芩素对金葡菌摄取头孢唑啉的影响  75-78
      3.6.1 头孢唑啉色谱图及标准曲线，回收率和日内精密度  75-77
      3.6.2 MRSA和ATCC菌体内头孢唑啉的浓度  77-78
    3.7 黄芩素对MRSA自溶酶谱及活性的影响  78-79
    3.8 黄芩素对β-内酰胺酶活性的影响  79
  4. 讨论  79-88
  参考文献  88-94
结论  94-95
综述  95-106
致谢  106-107
攻读博士学位期间发表的论文  107

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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