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志贺菌多重耐药的分子机制研究

作　者: 宋春花
导　师: 段广才
学　校: 郑州大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 志贺菌多重耐药抑制性消减杂交蛋白质组学双向电泳质谱分析差异表达
分类号: R446.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

志贺菌属(Shigella spp．)引起的细菌性痢疾发病率居我国传染病发病率的前三位。近年来随着抗生素的广泛使用、甚至滥用，使志贺菌频繁出现耐药株，且耐药率高、耐药产生速度快、范围广、多重耐药，1996年WHO认定志贺菌为给人类带来巨大威胁的耐药性菌株。国内外资料显示志贺菌属多重耐药现象严重，因此深入系统地了解志贺菌多重耐药机制及如何解决多重耐药性问题已成为目前细菌性痢疾的主要研究热点。细菌对不同结构类别或不同作用机制的抗菌药物都能产生耐药性，即多重耐药(multi-drug resistant)。目前对志贺菌多重耐药机制的研究表明：志贺菌对氨基糖苷类抗生素的耐药主要是通过表达AAC(3)Ⅱ酶；对β-内酰胺类抗生素的耐药主要是表达β-内酰胺酶破坏抗生素结构；志贺菌对喹喏酮类抗生素的耐药机制主要源于靶基因DNA旋转酶(gyrA．gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC，parE)发生突变；另外，志贺菌Mr43，000外膜蛋白表达减少，marA基因存在点突变导致膜耐药；有研究表明acrA基因介导的主动流出机制在临床多重耐药志贺菌中存在；在志贺菌整合子耐药机制方面，Ⅱ型整合子起主要作用。以上这些耐药机制不是相互孤立存在的，它们所产生的协同作用使志贺菌产生了对多种抗菌药的高度耐药性即高水平的多重耐药性。细菌获得耐药性主要通过药物自身诱导的垂直方式及基因水平转移方式两种途径获得。无论何种方式导致的细菌多重耐药都是多基因、多蛋白参与的一个复杂过程，而当前的研究多局限于某一机制的个别基因及蛋白，不但难以解释细菌多重耐药的全部现象，更不能全面揭示细菌多重耐药的分子基础及机制。目前尚缺乏志贺菌从敏感株转变为多重耐药株的系统的、全面的研究和评价资料，而本课题的设计立足于整体，从全基因组、蛋白质组的角度研究志贺菌的耐药机制。本课题以对多种抗生素敏感的志贺菌株为研究对象，采用抗生素次抑菌浓度自身诱导及接合基因转移两种方式，分别构建多重耐药菌株，通过抑制性消减杂交技术阐明志贺菌多重耐药的核酸基础；通过对志贺菌多重耐药蛋白质组学研究，从蛋白质水平上阐明志贺菌多重耐药相关蛋白的种类及其作用；并综合评价志贺菌在多重耐药产生过程中获得耐药性的主要方式及其共存的耐药机制，为志贺菌的分子流行病学监测、研发新型抗菌药物及指导临床正确使用抗生素提供科学依据。实验方法1．最低抑菌浓度的测定以头孢噻吩(cefalotin，CF)、诺氟沙星(norfloxacin，NOR)、庆大霉素(gentamycin，GM)、磺胺甲基异恶唑(cotrimoxazole，SMZ)四种抗生素为指示药物，采用改良Kirby-Bauer法筛选临床分离的福氏志贺菌敏感株和大肠埃希菌多重耐药株，用琼脂稀释法测定抗菌药物对志贺菌敏感株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。2．次抑菌浓度诱导实验志贺菌敏感株在1／2 MIC的抗生素LB培养基中连续12代培养，若诱导后MIC≥4倍诱导前即为诱导多重耐药菌株(以下简称诱导株)。3．接合转移实验以筛选出的志贺菌敏感株为受体菌，以多重耐药大肠埃希菌为供体菌，在约4倍MIC抗生素浓度作用下进行接合转移构建志贺菌基因转移多重耐药株(以下简称转移株)。4．志贺菌多重耐药抑制性消减杂交文库的构建采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)实验(1)采用细菌基因组提取试剂盒提取志贺菌敏感株、诱导株及转移株的全基因组DNA，以志贺菌敏感株基因组DNA为参照(Driver)，诱导株、转移株基因组DNA为样本(Tester)，Tester和Driver的DNA分别用同一种识别四碱基序列的限制性内切酶Rsa I四碱基酶切获得平均长度约600bpDNA片段。(2)将Tester DNA均分为两份，分别接上接头Adaptor I和Adaptor 2R。接头外侧序列与第1次PCR引物序列相同，而内侧序列则与第2次巢式PCR引物序列相同，有利于后续PCR的筛选扩增。此外接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点，为以后克隆和测序提供方便。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定连接效率在25％以上，说明DNA片段与接头连接效率较高。(3)两轮消减杂交：用过量Driver DNA样品分别与上述两份连有接头的Tester DNA样品进行第1次消减杂交。然后，混合上述两份杂交样品，同时加入新的变性Driver DNA进行第2次消减杂交，这一次杂交进一步富集了差异DNA。(4)两次PCR反应：加入根据接头设计的引物进行两次PCR；第一次PCR基于抑制反应，只有两端连接有2个不同接头的双链DNA片段才能得到指数扩增。第二次PCR实际上是巢式PCR，极大地提高了扩增特异性，使目的基因片段得到大量富集。(5)消减效率的检测：以经消减杂交和未经消减杂交第2轮PCR产物为模板，23S rRNA 5’和3’primers为引物进行PCR扩增，评价消减效率。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定两次PCR产物及消减效率。(6)将诱导及基因转移多重耐药抑制性消减杂交产物与pMD18-T载体连接并转化DH5 a高效感受态细胞，克隆增殖，蓝白斑筛选阳性克隆，并对全部阳性克隆30％甘油保存，构建抑制性消减杂交文库。5．志贺菌多重耐药相关基因的筛选采用PCR技术分别对两个消减杂交文库中部分阳性克隆鉴定后利用斑点杂交对鉴定的阳性克隆PCR产物进行筛选。对筛选到的多重耐药相关基因用M13双向引物测序，并将测序结果在BLAST上进行同源性比对。6．志贺菌多重耐药的蛋白质组学分析(1)应用双向电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)技术比较志贺菌多重耐药株与敏感株的全菌蛋白表达谱。采用超声兼Urea-CHAPS-DTT裂解提取法制备志贺菌敏感株、诱导株、转移株全菌蛋白，Bradford法蛋白定量。(2)将提取的三种菌株的100μg全菌蛋白在IPGphor水平电泳仪上进行第一相等电聚焦，然后在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中分别平衡15min；转移到第二相SDS-PAGE凝胶，在恒功率(18W／gel)条件下进行分离。分析型凝胶采用银染染色，制备型凝胶采用考马斯亮兰染色。(3)用Amersham Bioscience的扫描仪投射扫描，分辨率为300dpi。数字化图像文件运用Image Master 2D Platinum软件分析。(4)全部差异蛋白质点切下-80℃保存，挑取部分差异蛋白点做MOLDI-TOF质谱鉴定，利用Mascot(http://prospector.ucsf.edu/)和Profound(http://129.85.19.192/profound bin/WebProFound.exe)软件，在NCBInr蛋白数据库中检索。结果1．诱导及转移株的获得琼脂稀释法测定四种药物对志贺菌敏感株的MIC分别为CF 32mg／L、NOR 0.5mg／L、GM 2mg／L、SMZ 512mg／L。(1)次抑菌浓度(1／2MIC)诱导多重耐药结果：志贺菌诱导后的多重耐药菌株，分别是出发菌株的6倍(CF)、6倍(NOR)、8倍(GM)、8倍(SMZ)MIC。(2)接合转移多重耐药结果：志贺菌敏感株经与多重耐药大肠杆菌接合转移实验后，基因转移多重耐药志贺菌的MIC分别是头孢噻吩256mg／L、诺氟沙星4.0mg／L、庆大霉素20mg／L、磺胺甲基异恶唑5120mg／L。将基因转移后多重耐药的志贺菌作药敏试验，结果4种药物均无抑菌环出现。2．志贺菌多重耐药抑制性消减杂交文库的构建(1)连接效率检测可见由引物23S rRNA Forward Primer与接头1，2外侧序列引物PCR Primerl扩增所得条带的亮度和由引物23S rRNA Forward与ReversePrimer扩增所得条带的亮度相差小于2倍，表明连接效率大于50％。(2)经两轮消减杂交、两轮抑制性PCR后，差异片段大量富集，诱导及基因转移多重耐药消减杂交产物扩增的DNA条带成弥散状分布，大小从100～2000bp，与预期结果相符。(3)本次实验消减效率分析表明，消减后的转移株及诱导株DNA均在28个循环之后才看到23S rRNA扩增产物，而未消减的转移株及诱导株DNA可在18个循环就看到23S rRNA产物，说明两份样品的消减效率均较高。(4)志贺菌敏感株与诱导株抑制性消减杂交基因片段经与pMD18-T载体连接、转化克隆后，共获得1512个阳性克隆，随机挑取了216个阳性克隆做菌液PCR鉴定，有202个克隆含有插入片段，转化率为93.52％；同样敏感株与转移株共获得1080个阳性克隆，随机挑取了192个阳性克隆做菌液PCR鉴定，有181个克隆含有插入片段，转化率94.27％，且所有片段长度均在2000bp以下，与预期相符。3．志贺菌多重耐药相关基因(1)对诱导多重耐药消减杂交文库中80个阳性克隆巢式PCR产物进行斑点杂交筛选诱导多重耐药相关基因片段，共获得12个差异基因片段。经测序并检索分析，除一个片段未得到序列外，其余11个差异片段中有5个未检索到同源序列，为未知基因，其余6个分别为：前62及后41个碱基为16S rRNA核糖体基因(但中间序列未知)；假定的Rep蛋白质(解螺旋酶)；位点特异性Ⅰ型脱氧核糖核酸酶；预测的膜融合蛋白流出泵；SEcp1-like transposase (tnpA)转座酶基因；ISaba1转座酶。其中转座酶基因出现了2个拷贝数。(2)同样对基因转移多重耐药消减杂交文库中80个阳性克隆巢式PCR产物进行斑点杂交筛选基因转移多重耐药相关基因片段，共获得10个差异基因片段。经测序并检索分析，10个差异片段有5个未检索到同源序列，为未知序列，可能为基因转移多重耐药相关新基因；其余5个分别为：肺炎克雷伯杆菌Tn3926转座子部分的转座酶基因、假定的蛋白质及Gnt蛋白(藓样芽胞杆菌)、DNA旋转酶基因b亚单位、23S rRNA核糖体核糖核酸。其中DNA旋转酶基因b亚单位出现了2个拷贝数。4．志贺菌多重耐药蛋白质组学分析结果(1)志贺菌敏感株、诱导及转移株全菌蛋白双向电泳结果：成功地获得了志贺菌三种菌株的双向电泳图谱。三次重复实验后，志贺菌敏感株全菌蛋白进行双向电泳分离共获得946±37个蛋白质斑点；志贺菌转移株共获得1013±157个蛋白质斑点；志贺菌诱导株共获得1096±189个蛋白质斑点。(2)志贺菌敏感株与诱导株蛋白质差异表达分析：以诱导多重耐药双向凝胶图谱为参考凝胶，与敏感株进行匹配，共发现48个差异表达的蛋白点，其中8个蛋白点只存在于诱导株中，8个蛋白点只存在于敏感株中，26个蛋白点随着志贺菌由敏感株向多重耐药株转变而表达量增加，其余6个蛋白点表达量下降。其中5个差异蛋白质谱鉴定为ABC转运蛋白、谷胺酰转肽酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、翻译延长因子Tu、单链DNA结合蛋白，其中前三个蛋白在诱导株中表达量增加，后两个下降。(3)志贺菌敏感株与转移株蛋白质差异表达分析：以转移株双向凝胶图谱为参考凝胶，与敏感株进行匹配，共发现43个差异表达的蛋白点，其中8个蛋白点只存在于转移株中，6个蛋白点只存在于敏感株中，有22个蛋白点随着志贺菌由敏感株向多重耐药株转变而表达量增加，7个蛋白点表达量下降。对其中7个差异蛋白进行质谱鉴定：转移株中发现两个新出现的多重耐药相关蛋白，分别为CRISPR相关蛋白及Hsp60的分子伴侣蛋白(Groel-Groes-Adp7)。表达量上调的蛋白有ABC转运蛋白、胱氨酸合成酶、预测的胞浆脂蛋白。而翻译延长因子Tu，单链DNA结合蛋白在敏感株中高表达。结论1成功构建了来自于同一志贺菌敏感株的药物诱导及基因水平转移多重耐药株，同源性及可比性好。2成功地利用抑制性消减杂交技术构建了志贺菌敏感株与诱导株及转移株抑制性消减杂交基因组文库。3部分差异基因筛选结果显示：与药物诱导多重耐药相关的机制有16S rRNA介导的氨基糖苷类抗生素的耐药机制，Rep蛋白调节的质粒耐药，膜融合蛋白流出泵介导的主动流出机制，限制-修复系统，转座子耐药模式，与基因转移多重耐药相关机制有23S rRNA介导的大环内酯类抗菌药物的耐药机制，转座子耐药模式，葡萄糖代谢gnt操纵子，以及DNA旋转酶基因b亚单位介导的喹诺酮类药物的耐药机制。4首次发现转座子耐药模式在垂直诱导及基因水平转移两种多重耐药方式中均存在。5新发现了5个诱导多重耐药相关基因片段及5个基因转移多重耐药相关基因片段，可能代表某些未知多重耐药机制。6首次建立志贺菌临床分离株全菌蛋白质双向电泳图谱，并通过对此方法的改进，共分离出946±37个蛋白质斑点。7部分差异蛋白的蛋白质组学分析表明：无论敏感株是通过垂直诱导还是基因水平转移方式获得多重耐药性，一些在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量均上调；首次发现ABC转运蛋白在志贺菌两种方式多重耐药机制中起重要作用。8 CRISPR相关蛋白及Hsp60的分子伴侣蛋白为仅在转移株中出现的蛋白，可能代表了基因水平转移多重耐药的新机制。9综合基因组学及蛋白质组学研究结果，证实志贺菌的多重耐药是在各种代谢酶调节下多机制共同参与的复杂过程。

全文目录

中文摘要  5-12
ABSTRACT  12-24
论文志贺菌多重耐药的分子机制研究  24-157
  引言  24-29
    研究背景及目的、意义  24-27
    研究内容  27-28
    研究技术路线图  28-29
  第一部分志贺菌多重耐药菌株的构建  29-40
    材料与方法  30-33
    结果  33-36
    讨论  36-39
    小结  39-40
  第二部分志贺菌多重耐药抑制性消减杂交文库的构建  40-68
    材料与方法  44-54
    结果  54-60
    讨论  60-67
    小结  67-68
  第三部分志贺菌多重耐药相关基因分析  68-96
    材料与方法  68-72
    结果  72-87
    讨论  87-95
    小结  95-96
  第四部分志贺菌多重耐药的蛋白质组学研究  96-136
    材料与方法  97-105
    结果  105-124
    讨论  124-134
    小结  134-136
  结论  136-137
  参考文献  137-157
综述细菌多重耐药分子机制研究进展  157-183
附录  183-187
  致谢  183-184
  图表索引  184-187
  在读期间发表学术论文  187

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